TRANSFERT DE GÈNES ASSISTÉ PAR ÉLECTROPORATION INCORPORÉ DANS L’AGAROSE DANS DES PROGÉNITEURS D’INTERNEURONES CORTICAUX DE SOURIS

1. Injections d’ADN focales
   1. Préparez un mélange d’acide désoxyribonucléique (ADN) de vecteurs d’expression : pCAGGs-IRES-GFP (vecteur de contrôle) + pCAGGs-hM3D(Gq)-IRES-RFP, à une concentration de 1 μg/μL pour chaque vecteur. Ajouter une solution verte rapide (stock 25 mg/mL) dans une dilution de 1/10.
   2. Remplissez une micropipette en verre tiré (0,5 mm de diamètre intérieur et 1 mm de diamètre extérieur) avec 10 μL du mélange d’ADN et injectez de petites quantités (dans la gamme 25-50 nL) dans la région sélectionnée (éminence ganglionnaire médiale ou MGE/ganglionnaire caudale ou CGE) de la tranche (figure 1 et figure 2).
2. Électroporation aiguë
   REMARQUE : L’électroporation doit être effectuée immédiatement après l’injection focale d’ADN.
   1. Place le petit bloc d’agarose sur l’électrode de la boîte de Pétri et fixe la colonne d’agarose à l’électrode du couvercle mobile à l’aide d’une micro-spatule à extrémité plate.
   2. Transférez la tranche avec sa membrane de support sur le bloc d’agarose et placez l’électrode supérieure avec la colonne d’agarose au-dessus de la région sélectionnée (MGE/CGE) de la tranche.
      REMARQUE : Des tensions de charge de 125 V (deux impulsions de 5 ms chacune, intervalle de 500 ms) permettent une électroporation réussie (Figure 3).
3. Après l’électroporation, placez la tranche avec sa membrane de support dans la boîte et transférez-la dans un incubateur de culture tissulaire de CO₂ à 37 °C.

Figure 1 : Tranches télencéphales représentatives utilisées pour les expériences d’électroporation aiguë. (A-C) Des coupes télencéphales ont été obtenues à trois niveaux rostrocaudaux séquentiels distincts, colorées au 4′,6-diamidino-2-phénylindole (DAPI). LGE : éminence ganglionnaire latérale ; MGE : éminence ganglionnaire médiale ; CGE : éminence ganglionnaire caudale. Barres d’échelle = 200 μm. Les astérisques jaunes indiquent le site d’électroporation dans chaque tranche. La ligne blanche marque le bord de l’éminence ganglionnaire.

Figure 2 : Représentation schématique du flux de travail expérimental. (A) Les tranches de cerveau de souris sont électroporées avec des constructions appropriées, et (B) après 12 h, les précurseurs modifiés de l’interneurone cortical (IC) sont isolés et (C) transplantés dans le pallium de petits souris nouveau-nés (P0−P2). Afin de modifier l’activité des IC immatures, des petits P14 ayant reçu des greffes cellulaires ont reçu une injection de CNO ou de véhicule pendant quatre jours constitutifs selon le protocole présenté. (A') Photographie de la configuration d’électroporation aiguë du cerveau de la souris.

Figure 3 : Expérience représentative réussie d’électroporation en tranches aiguës. (A) Coupe coronale représentative d’un cerveau embryonnaire E14.5 transfectée dans l’EGC avec les plasmides pCAGGs-IRES-GFP (protéine fluorescente verte) et pCAGGs-hM3D(Gq)-IRES-RFP (protéine fluorescente rouge) et cultivée pendant 12 h. La section a été immunomarquée pour les GFP (A, B, C) et les RFP (A, B, D). La zone encadrée du panneau A est agrandie pour montrer l’expression des rapporteurs fluorescents (B), GFP (C) et RFP uniquement (D). La ligne blanche marque le bord de l’éminence ganglionnaire. B-D : même photo, canaux différents ou une combinaison des deux canaux différents. Barres d’échelle = 200 μm (A), 100 μm (B-D).