TRANSFERT DE GÈNES ASSISTÉ PAR ÉLECTROPORATION INCORPORÉ DANS L’AGAROSE DANS DES PROGÉNITEURS D’INTERNEURONES CORTICAUX DE SOURIS

Résumé

Source : Denaxa, M., el al., Transplantation de progéniteurs d’interneurones corticaux modifiés par chimiogénétique dans des cerveaux de souris postnatals précoces. J. Vis. Exp. (2019)

Cette vidéo montre la procédure d’injection d’un vecteur plasmidique porteur du gène d’intérêt dans les progéniteurs interneurones d’une tranche de cerveau embryonnaire, suivie d’une électroporation pour l’entrée du plasmide et l’expression génique. Ces progéniteurs modifiés peuvent ensuite être utilisés pour traiter les troubles cérébraux.

Protocole

1. Injections d’ADN focales
   1. Préparez un mélange d’acide désoxyribonucléique (ADN) de vecteurs d’expression : pCAGGs-IRES-GFP (vecteur de contrôle) + pCAGGs-hM3D(Gq)-IRES-RFP, à une concentration de 1 μg/μL pour chaque vecteur. Ajouter une solution verte rapide (stock 25 mg/mL) dans une dilution de 1/10.
   2. Remplissez une micropipette en verre tiré (0,5 mm de diamètre intérieur et 1 mm de diamètre extérieur) avec 10 μL du mélange d’ADN et injectez de petites quantités (dans la gamme 25-50 nL) dans la région sélectionnée (éminence ganglionnaire médiale ou MGE/ganglionnaire caudale ou CGE) de la tranche (figure 1 et figure 2).
2. Électroporation aiguë
   REMARQUE : L’électroporation doit être effectuée immédiatement après l’injection focale d’ADN.
   1. Place le petit bloc d’agarose sur l’électrode de la boîte de Pétri et fixe la colonne d’agarose à l’électrode du couvercle mobile à l’aide d’une micro-spatule à extrémité plate.
   2. Transférez la tranche avec sa membrane de support sur le bloc d’agarose et placez l’électrode supérieure avec la colonne d’agarose au-dessus de la région sélectionnée (MGE/CGE) de la tranche.
      REMARQUE : Des tensions de charge de 125 V (deux impulsions de 5 ms chacune, intervalle de 500 ms) permettent une électroporation réussie (Figure 3).
3. Après l’électroporation, placez la tranche avec sa membrane de support dans la boîte et transférez-la dans un incubateur de culture tissulaire de CO₂ à 37 °C.

Résultats

Figure 1 : Tranches télencéphales représentatives utilisées pour les expériences d’électroporation aiguë. (A-C) Des coupes télencéphales ont été obtenues à trois niveaux rostrocaudaux séquentiels distincts, colorées au 4′,6-diamidino-2-phénylindole (...

Matériaux