Injection de vecteurs adéno-associés recombinants dans un modèle murin d’atrophie musculaire spinale et bulbaire

Résumé

Source :
Pourshafie, N., et al. Administration systémique de microARN à l’aide d’un virus adéno-associé recombinant de sérotype 9 pour traiter les maladies neuromusculaires chez les rongeurs. J. Vis. Exp. (2018).

Dans cette vidéo, une souris atteinte d’amyotrophie spinale et bulbaire ou atteinte de SBMA subit une injection dans la veine de la queue de vecteurs AAV (vecteurs adéno-associés) recombinants porteurs d’un plasmide codant pour un microARN thérapeutique. Le vecteur produit des microARN qui se lient à l’ARNm (acide ribonucléique messager) AR (récepteur des androgènes) mutant, déclenchant sa dégradation. Cela réduit l’accumulation de protéines toxiques et aide à améliorer la fonction neuromusculaire.

Protocole

Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.

1. Injection dans la veine caudale du plasmide AAV-miRNA

REMARQUE : Cette étape doit être ajustée en fonction du gène cible et de l’âge et du poids des souris. Utiliser les lignes directrices de l’Institutional and Animal Care and Use Committee (IACUC) pour déterminer la gamme de doses, le volume et la meilleure voie d’administration en fonction de l’âge et du poids des souris. Le signal de fluorescence GFP (Green fluorescent protein) et les niveaux d’expression des miARN dans les tissus cibles devraient atteindre un pic à partir de 2 semaines après l’injection. Le protocole suivant fait référence aux souris mâles au début de l’âge adulte. Les AAV doivent être traités comme un risque biologique selon les directives de biosécurité de niveau 1.

1. Diviser le stock plasmidique de miARN AAV en aliquotes de 100 à 200 μL contenant une charge virale de 10,¹⁰ à 10¹¹ génomes viraux par mL (vg/mL) à l’aide d’une solution saline tamponnée au phosphate stérile (PBS). Un équipement de protection individuelle contre les risques biologiques en laboratoire doit être utilisé pour manipuler la solution AAV.
   REMARQUE : Une fois qu’une aliquote est décongelée, elle peut être conservée à 4 °C pendant une période pouvant aller jusqu’à deux semaines. Le stock viral peut être conservé dans un congélateur à -80 °C.
2. Attachez la souris dans des dispositifs de contention disponibles dans le commerce, tels que des tubes en plastique ou en film plastique conique de taille appropriée.
3. Nettoyez la surface de la queue avec des lingettes alcoolisées à 70 %.
4. Tenez un tampon chaud (28-30 °C) sous la queue pendant 30 secondes pour augmenter la vasodilatation. Alternativement, réchauffez les animaux à l’aide d’une lampe chauffante rouge (à une distance de 2-3 pieds) ou en trempant la queue dans de l’eau chaude.
5. En partant de la partie distale de la queue, insérez l’aiguille (27-30 G) chargée de l’aliquote virale, biseautez vers le haut, à 15° de la queue, dans la veine. Avant l’injection, assurez-vous que l’aiguille est correctement insérée.
   1. Si une résistance est ressentie lors de l’injection ou si un gonflement apparaît sous la peau, arrêtez la procédure. Retirez l’aiguille et réinsérez-la au-dessus du site d’injection précédent.
      REMARQUE : Vous pouvez également y parvenir en aspirant doucement l’aiguille et en observant le sang. Une aspiration dure peut affaisser la veine de la queue. Si la veine blanchit pendant l’injection, l’aiguille est insérée correctement.
6. Une fois l’injection terminée, attendez quelques secondes avant de lever l’aiguille.
7. Observez le site d’injection pour détecter tout saignement. Appliquez une pression modérée à l’aide de deux doigts sur le site jusqu’à ce que le saignement cesse.
8. Remettez l’animal dans sa cage.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Scale	Pelouze	SP5
Nalgene bucket	Thermo Scientific	12014000	4000 mL
Microcentrifuge	tube USA Scientific	1615-5500
Lactated Ringer’s Solution	Baxter Healthcare	0338-0114-04
Mini vortexer	Fisher Scientific	128101
Centrifugeuse	Eppendorf	22624415
Film de laboratoire	Bemis	PM996
Seringue de 1 mL	BD	309626	Livré avec une aiguille de 25g attachée. Remplacer par une aiguille injectable de 27-30 g Aiguille
30 g	BD	305106
Isoflurane	Piramal Healthcare	66794-013-25	Isoflurane USP 250 mL
Masque d’anesthésie	Kopf Instruments	906
Gauze	Henry Schein	100-2524	2 » x 2 » (5cm x 5cm)
Pointes de pipette	USA Scientific	1111-0816
Micropipet	Gilson	4642080
Vaporisateur d’anesthésie à gaz	SurgiVet	4214322	Classic T3
Capteur d’anesthésie à gaz	SurgiVet	32373B10	Enviro-PURE
Coussin chauffant	Sears	17280
Coussin de paillasse	VWR	56617-006
Rotarod	Panlab/ Appareil Harvard	76-0772	4 rats/ 4 souris 70
% éthanol	Decon Laboratories, Inc.	2401	140 preuve
70 % Isopropanol	VWR	89108-160

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