Injection intracrânienne de métabolites microbiens dérivés de l’intestin dans un modèle murin

Résumé

Source : Liou, C. et al. Administration intra-ventriculaire de métabolites microbiens dérivés de l’intestin chez des souris se déplaçant librement. J. Vis. Exp. (2022).

Cette vidéo démontre l’injection intracrânienne d’acides gras à chaîne courte (AGCC) chez une souris se déplaçant librement pour étudier leurs effets sur le comportement médié par le cerveau. Une canule d’injecteur est insérée dans une canule guide implantée dans le cerveau de la souris. Après sa guérison, la souris s’acclimate dans une nouvelle cage. Des AGCC sont ensuite administrés et le comportement locomoteur est enregistré.

Protocole

Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.

1. Préparation pour l’animal de laboratoire

1. Procurez-vous des souris mâles C57BL/6JNarl de type sauvage âgées de 6 à 8 semaines auprès d’un vendeur.
2. Hébergez les souris dans une cage à souris standard avec de la nourriture pour souris standard et de l’eau stérilisée à volonté.
   REMARQUE : Les conditions d’hébergement du Centre des animaux de laboratoire sont de 22 ± une température de 1 °C, une humidité de 55 % ± 10 % et un cycle lumière/obscurité de 13 h/11 h.

2. Chirurgie stéréotaxique

1. Préparez et stérilisez l’instrument stéréotaxique, les instruments chirurgicaux et les articles connexes.
   REMARQUE : Tous les articles qui entreront directement en contact avec le site chirurgical doivent être stérilisés pour éviter l’infection.
2. Anesthésiez la souris en la plaçant dans la cage en plexiglas avec 1 à 5 % d’isoflurane dans de l’oxygène.
   REMARQUE : Observez attentivement la souris pour vous assurer que la fréquence respiratoire est maintenue à environ une respiration par seconde.
3. Sortez la souris de la chambre d’anesthésie. Rasez le site chirurgical (tête de souris) avec une tondeuse pour animaux. Placez la souris sur le cadre stéréotaxique en fixant les incisives de la souris sur la barre d’incisive dans le support d’incisives stéréotaxique. Couvrez le nez avec le masque à cône nasal.
4. Anesthésier la souris avec 1 à 2,5 % d’isoflurane dans de l’oxygène tout au long de la chirurgie stéréotaxique. Évaluer la nociception de la souris via le réflexe de pincement des orteils et assurer une fréquence respiratoire constante avant d’inciser le site chirurgical.
5. Placez un coussin chauffant (37,0 °C) sous la souris sur le cadre stéréotaxique pour maintenir la température corporelle pendant l’opération. Vous pouvez également maintenir la température à cœur à l’aide d’une sonde thermique rectale reliant le réchauffeur programmé et le coussin chauffant.
6. Retirez la fourrure coupée sur la tête à l’aide de ruban adhésif. Injectez à la souris l’analgésique kétoprofène (5 mg/kg) par voie sous-cutanée pour soulager la douleur. Appliquez une pommade pour les yeux pour éviter la sécheresse oculaire.
7. Insérez la barre d’oreille pointue dans le conduit auditif pour fixer la tête.
8. Centrez la tête en ajustant l’échelle de la barre d’oreille.
9. Serrez le pince nasale sur le support d’incisive pour éviter tout mouvement vertical. Appuyez doucement sur la tête pour vérifier que la tête est fixe et éviter que la tête ne se détache lors d’une intervention chirurgicale ultérieure.
10. Désinfectez le cuir chevelu avec trois gommages alternés de chlorhexidine à l’aide d’un coton-tige. Commencez chaque broussaille du milieu vers l’extérieur (de la zone centrale la plus désinfectée à la zone la moins désinfectée).
    REMARQUE : L’utilisation de blouses du milieu vers l’extérieur pourrait aider les scientifiques à minimiser l’infection et la contamination de la fourrure. La zone externe est proche de la région de la tête non rasée, qui a encore une grande quantité de fourrure et n’est pas facile à désinfecter en profondeur.
11. Inciser le cuir chevelu de manière antérieure/postérieure (<1 cm) à l’aide d’une lame chirurgicale. Ouvrez l’incision et essuyez le crâne à l’aide d’un coton-tige tenu par une pince de microdissection.
    REMARQUE : La pince de microdissection, la lame chirurgicale et les cotons-tiges doivent être stérilisés à l’autoclave avant l’intervention chirurgicale. Pendant le processus chirurgical, stérilisez tout le matériel chirurgical à l’aide d’un stérilisateur à billes de verre (150 °C) pendant au moins 5 s avant et après chaque animal. Préparez un bécher stérilisé pour tenir la lame chirurgicale et la pince pendant le processus chirurgical et entre les animaux.
12. Identifiez le Bregma et le Lambda sur le crâne. Utilisez le Bregma comme référence pour localiser la région d’intérêt.
    1. Facultatif : Montez la perceuse stéréotaxique sur le porte-perceuse stéréotaxique, et utilisez la pointe de la perceuse pour indiquer Bregma comme référence. Stérilisez la perceuse stéréotaxique à l’aide du stérilisateur à billes de verre (150 °C) pendant au moins 5 s.
13. Calibrez et alignez le plan horizontal plat du crâne dans les plans gauche/droite et avant/postérieur à l’aide de Bregma/Lambda.
    REMARQUE : Si ce n’est pas dans un plan horizontal correct, remontez la souris sur l’instrument stéréotaxique.

3. Implantation commerciale d’une canule guide personnalisée

1. Identifiez et étiquetez la position du ventricule latéral droit en fonction des coordonnées stéréotaxiques : Distance au Bregma, antérieur/postérieur (A/P) : 0,26 mm, médial/latéral (M/L) : -1,0 mm, dorsal/ventral (D/V) : -2,0 mm.
   REMARQUE : Les coordonnées peuvent être modifiées en fonction de la région d’intérêt. Les coordonnées du ventricule latéral ont été basées sur des souris C57BL/6J adultes d’un poids de 26 à 30 g.
2. Percez un trou (diamètre = 1,5 mm) à travers le crâne à l’endroit marqué à l’aide d’une perceuse stéréotaxique pour l’implantation d’une canule guide commerciale.
3. Percez deux à quatre autres trous (diamètre = 1,5 mm) sur le crâne à l’aide d’une perceuse stéréotaxique pour le montage de vis en acier inoxydable.
   REMARQUE : Stérilisez la perceuse stéréotaxique à l’aide d’un stérilisateur à billes de verre (150 °C) pendant au moins 5 s avant et après chaque animal.
4. Essuyez les restes d’os et arrêtez le saignement avec un coton-tige.
5. Essuyez le crâne avec de la lidocaïne (1 mg/kg) à l’aide d’un coton-tige pour des effets anesthésiques locaux, antiprurigineux et analgésiques. Si le saignement ne s’arrête pas après le forage, placez doucement un coton-tige sur le trou pour l’hémostase.
6. Montez deux à quatre vis en acier inoxydable sur les trous pour fournir des ancrages pour l’acrylique dentaire.
7. Placez la canule de guidage commerciale sur le support de canule stéréotaxique et désinfectez-la avec le stérilisateur à billes de verre (150 °C).
   REMARQUE : La canule de guidage commerciale, le mannequin commercial et l’injecteur commercial (Figure 1A) ont été personnalisés selon les spécifications indiquées dans le tableau des matériaux.
8. Déplacez le support de canule stéréotaxique dans le trou percé pour le ventricule latéral et insérez lentement la canule de guidage commerciale dans le trou jusqu’à la profondeur souhaitée (2,5 mm).
   REMARQUE : La coordonnée dorsale/ventrale peut être définie en réglant l’extrémité de la canule de guidage commerciale comme référence lorsque l’extrémité est à peine insérée dans le trou.
9. Appliquez 10 μL d’adhésif cyanoacrylate n-butyle (colle tissulaire) pour fixer la canule de guidage commerciale dans le trou percé et attendez 3-4 min. Libérez doucement la canule de guidage commerciale du support de canule stéréotaxique et éloignez le support.
10. Appliquez l’acrylique dentaire sur le cuir chevelu incisé pour fixer la canule guide commerciale et attendez au moins 5 min. Implantez la tétine commerciale dans la canule guide commerciale pour éviter que la canule ne soit obstruée par le sang ou les fluides corporels (Figure 1B).
11. Relâchez la barre d’oreille du conduit auditif et retirez la souris du cadre stéréotaxique.
12. Placez la souris dans une nouvelle cage avec un coussin chauffant en dessous pour la récupération de l’anesthésie et observez en permanence jusqu’à ce que la souris se réveille complètement.
    REMARQUE : Ne laissez pas l’animal sans surveillance jusqu’à ce qu’il ait repris suffisamment de conscience pour maintenir le décubitus sternal. Un animal qui a subi une intervention chirurgicale ne doit pas retourner en compagnie d’autres animaux avant d’être complètement rétabli.
13. Retournez la souris dans un logement individuel ou un logement de groupe, selon le protocole de l’Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) et la conception de l’expérience. Pour l’hébergement en groupe, assurez-vous que moins de souris sont logées dans une cage afin de minimiser les blessures indésirables ou le détachement de la canule.
14. Administrer de l’ibuprofène (0,2 mg/mL) dans l’eau de boisson pendant au moins 3 jours pour les soins postopératoires, et surveiller deux fois par jour les signes de douleur et de détresse pendant au moins 3 jours.
    1. Pendant les soins postopératoires, appliquez une pommade à la roxithromycine autour de la peau pour prévenir l’inflammation et l’infection chez les souris.
    2. Continuez à surveiller l’état de l’animal et administrez une injection intrapéritonéale opportune de glucose à 5 % et/ou de chlorure de sodium à 0,9 % pour fournir suffisamment d’énergie.
    3. Si l’état de douleur, de détresse ou d’infection se détériore régulièrement, euthanasier la souris par inhalation de CO₂.
15. Attendez 1 semaine après l’opération pour que la souris soit prête pour l’administration intra-ventriculaire d’acides gras à chaîne courte (AGCC) et les tests comportementaux.

4. Préparation des AGCC

1. Dissoudre l’acétate de sodium, le butyrate de sodium et le propionate de sodium dans du liquide céphalo-rachidien artificiel (ACSF) (voir le tableau des matériaux).
2. Assurez-vous que les produits chimiques sont complètement dissous, puis ajustez le pH à 7,4 et filtrez le mélange d’AGCC à travers un filtre de 0,22 μm pour la stérilisation.

5. Configurer le système de perfusion pour l’administration intracérébroventriculaire des AGCC pendant les tests comportementaux

1. Installez une caméra de plafond pour enregistrer le comportement. Connectez l’appareil photo à un ordinateur pour contrôler le logiciel d’enregistrement vidéo (Figure 2).
2. Remplissez une seringue de 10 μL avec de l’eau distillée.
   REMARQUE : Évitez les bulles d’air dans la seringue d’un microlitre.
3. Connectez une pompe de micro-injection au contrôleur de micro-injection.
4. Montez la seringue de microlitre sur la pompe de micro-injection. Pour installer la seringue, appuyez sur le bouton pour desserrer la pince et installez la seringue dans la position correspondante. Fermez le collier et serrez la vis de retenue du piston sur la pompe de micro-injection (Figure 3A).
5. Insérez l’injecteur commercial dans le tube en polyéthylène (Figure 1A).
6. Accrochez le tube de polyéthylène à la caméra de plafond au-dessus de l’arène d’essai.
7. Remplissez le tube en polyéthylène avec de l’eau distillée à l’aide d’une seringue à insuline. Connectez la seringue d’un microlitre au tube en polyéthylène suspendu.
   REMARQUE : Assurez-vous que le tube en polyéthylène est suffisamment long pour permettre à la souris de se déplacer librement dans l’arène de test.

6. Réglages système du contrôleur de micro-injection

1. Allumez le contrôleur de micro-injection et appuyez sur Afficher tous les canaux pour accéder à l’écran de commande (Figure 3C). Appuyez sur Configuration et réglez l’objectif de volume sur 9 800 nL avec le taux de livraison sur 100 nL/s. Infusez 9 800 nL d’eau distillée à partir du tube en polyéthylène relié à la seringue d’un microlitre (appuyez sur Instructions pour passer en mode Infuse et appuyez sur RUN) (voir les carrés rouges sur l’écran de commande de la figure 3C).
2. Appuyez sur Configuration et réglez l’objectif de volume sur 3 000 nL avec le débit sur 100 nL/s. Retirez 3 000 nL d’huile minérale (appuyez sur Direction pour passer en mode de retrait et appuyez sur RUN) (voir les carrés rouges sur l’écran de commande de la Figure 3C).
   REMARQUE : Une séparation claire entre l’huile et l’eau doit être observée sur le tube en polyéthylène.
3. Démontez le tube en polyéthylène de l’aiguille de la seringue d’un microlitre. Crachez 3 000 nL d’eau distillée à partir de l’aiguille de la seringue d’un microlitre (appuyez sur Direction pour passer en mode d’infusion et appuyez sur RUN).
4. Réinsérez la seringue de microlitre dans le tube en polyéthylène. Appuyez sur Configuration et réglez l’objectif de volume sur 9 500 nL avec un débit de 100 nL/s. Retirez 9 500 nL de SCFA (appuyez sur Direction pour passer en mode Retrait et appuyez sur RUN). Étiquetez la phase d’AGCC à l’huile pour valider si les AGCC sont perfusés avec succès.
5. Appuyez sur Configuration et réglez l’objectif de volume souhaité avec le débit sur 7 nL/s. Appuyez sur Direction pour passer en mode Infuse (voir les carrés rouges sur l’écran de commande de la Figure 3C).
   REMARQUE : Déterminez le volume en fonction du temps d’infusion. Par exemple, si le temps d’infusion est de 3 min pour un débit de 7 nL/s, volume cible = 1 260 nL.
6. Appuyez sur RUN pour infuser la seringue d’un microlitre vers l’avant jusqu’à ce que le liquide sorte à l’extrémité avant de l’injecteur commercial avant d’insérer l’injecteur dans la canule pour l’injection d’AGCC.

7. Perfusion d’AGCC dans le ventricule latéral à travers la canule guide commerciale chez une souris en mouvement libre

1. Anesthésisez la souris en la plaçant dans la cage en plexiglas avec 1 à 5 % d’isoflurane dans l’oxygène.
   REMARQUE : Observez attentivement la souris pour vous assurer que la fréquence respiratoire est maintenue à environ une respiration par seconde.
2. Ébouriffez la souris et insérez l’injecteur commercial dans la canule guide commerciale (Figure 3B).
   REMARQUE : Si la canule guide commerciale est obstruée par du sang ou des fluides corporels, débouchez-la doucement à l’aide d’une pince à épiler.
3. Laissez la souris se remettre de l’anesthésie pendant 15 minutes dans une cage avant le test comportemental.
4. Pour le test de locomotion de base, placez la souris dans une cage de roman et laissez-la explorer librement pendant 35 min. Infusez des AGCC en utilisant un débit de 7 nL/s pour un volume cible de 2 100 nL au cours des 5 premières minutes (appuyez sur Direction pour passer en mode d’imprégnation et appuyez sur RUN).
   REMARQUE : La locomotion dans la cage du roman peut être analysée à l’aide d’un logiciel de suivi vidéo du comportement animal.
5. Anesthésie la souris (en répétant l’étape 7.1) et retire l’injecteur commercial de la canule guide commerciale.
   REMARQUE : La souris peut être injectée à plusieurs reprises avec différents contrôles/métabolites après avoir donné le temps approprié pour éliminer l’injection précédente. Tant que la canule est fixée sur la tête de la souris, la souris peut être testée à plusieurs reprises avec différents métabolites.

8. Restauration du système de micro-injection

1. Démontez le tube en polyéthylène de la seringue de microlitre.
2. Injectez de l’air dans le tube à l’aide de la seringue à insuline pour jeter l’eau distillée dans le tube en polyéthylène. Videz la seringue d’un microlitre.
3. Appuyez sur Reset Pos sur l’écran de configuration pour ouvrir l’écran de définition de la figure d’arrêt de la seringue (Figure 3C).
4. Appuyez sur Retirer jusqu’à ce qu’un bip se produise pour remettre la pompe de micro-injection en position complètement retirée (Figure 3C).
5. Revenez à l’écran de commande et éteignez le contrôleur de micro-injection si le signe **END REACHED ** s’affiche sur cet écran (Figure 3C).

Résultats

Figure 1 : Implantation de la canule guide commerciale chez la souris. (A) L’image représentative d’une canule de guidage, d’un mannequin et d’un injecteur commerciaux. (B) L’image représentative d’une canule guide commerciale et d...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Material
Advil Liqui-gels Solubilized Ibuprofen A2 :D41	Pfizer	n/a
Bottle Top Vacuum Filter, 500 mL, 0.22 μm, PES, Stérile	NEST	121921LA01
CaCl₂	Sigma-Aldrich	C1016	ACSF : 0,14 g/L
Gommage à la chlorhexidine 2 %	Phoenix	NDC 57319-611-09
Solution de chlorhexidine	Phoenix	NDC 57319-599-09
Mannequin professionnel	RWD Life Science	62004	Single_OD 0,20 mm/ M3,5/G = 0,5 mm
Canule de guidage commerciale	RWD Life Science	62104	Single_OD 0,41 mm-27G/ M3,5/C = 2,5 mm
Injecteur professionnel	RWD Life Science	62204	Single_OD 0,21 mm-33G/ Accouplements avec M3,5/C = 3,5 mm/G = 0,5 mm
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G8270	ACSF : 0,61 g/L
Acrylique dentaire	HYGENIC	n/a
Vis de fixation	RWD Life Science	62521
Sérum de cheval	ThermoFisher Scientific	16050130
Seringues d’insuline	BBraun	XG-LBB-9151133S-1BX	1 mL
Isoflurane	Panion & BF biotech	DG-4900-250D
KCl	Sigma-Aldrich	P3911	ACSF : 0.19 g/L
Ketoprofène	Swiss Pharmaceutical	n/a
Lidocaïne	AstraZeneca	n/a
Agarose à bas point de fusion	Invitrogen	16520
MgCl₂	Sigma-Aldrich	M8266	ACSF : 0,19 g/L
Lames de microscope	ThermoFisher Scientific	4951PLUS-001E
Huile minérale légère, blanche NF	Macron Fine Chemicals	MA-6358-04
NaCl	Sigma-Aldrich	S9888	ACSF : 7,46 g/L
NaH₂PO₄	Sigma-Aldrich	S8282	ACSF : 0,18 g/L
NaHCO₃	Sigma-Aldrich	S5761	ACSF : 1,76 g/L
d’adhésif cyanoacrylate n-butyle (colle adhésive pour tissus)	3M	1469SB	3M Vetbond
Neural tracer	Santa Cruz	SC-358883	FluoroGold
Paraformaldéhyde	Sigma-Aldrich	P6148
Tube en polyéthylène	RWD Life Science	62329	OD 1.50, I.D 0.50 mm et OD 1.09, I.D 0.38 mm
Puralube Vet (œil) Pommade	Dechra	12920060
Acétate de sodium	Sigma-Aldrich	S2889	AGCC : 13.5 mM
Azoture de sodium	Sigma-Aldrich	S2002
Butyrate	de sodium Sigma-Aldrich	B5887	AGCC : 8 mM
Propionate	de sodium Sigma-Aldrich	P1880	EFCC : 5,18 mM
Canule de guidage en acier inoxydable	Chun Ta entreprise en acier inoxydable CO., LTD.	n/a	Diamètre extérieur 0,63 mm ; Fournisseur local
Injecteur en acier inoxydable	Chun Ta entreprise en acier inoxydable CO., LTD.	n/a	OD 0,3 mm ; le mannequin est fabriqué à partir d’un injecteur ; fournisseur local
Superglue	Krazy Glue	KG94548R
Triton X-100	Merck	1.08603.1000
Équipement
Support de canule	RWD Life Science	B485-68217
Caméra de plafond	FOSCAM	R2
Instruments stéréotaxiques numériques	Stoelting	51730D
Microscope de dissection	INNOVIEW	SEM-HT/TW
Stérilisateur à billes de verre	RWD Life Science	RS1501
Coussin chauffant	Stoelting	53800M
Micro Pince de dissection	ROBOZ	RS-5136	Dentelé, légère courbure ; Extra délicat ; Largeur de pointe de 0,5 mm ;
Micro Ciseaux de dissection	ROBOZ	RS-5918	4.5 » Angle Sharp
	World Precision Instruments (WPI)	MICRO2T	SMARTouch Controller
Pompe à seringue de micro-injection	World Precision Instruments (WPI)	UMP3T-1	UltraMicroPump3
Seringue de microlitres	Hamilton	80014	10 μL
Fibre optique Lumière froide avec double étape de fibre		LGY-150	Fournisseur local
Tondeuse pour animaux	de compagnie WAHL	09962-2018
Logiciel
suivi vidéo du comportement des animaux	Noldus	EthoVision	Version : 15.0.1416

4 » Longueur Contrôleur de micro-injection de