Spectroscopie Raman anti-Stokes cohérente pour visualiser les neurones myélinisés dans le tissu cérébral de souris

Résumé

Source : McCullagh, E. A., et al. Application de la spectroscopie Raman anti-Stokes cohérente (CARS) pour l’imagerie de la myélinisation dans des tranches de cerveau. J. Vis. Exp. (2022)

La vidéo fait la démonstration de l’imagerie par fluorescence et spectroscopie Raman anti-Stokes cohérente (CARS) pour visualiser l’architecture neuronale dans le tissu cérébral des rongeurs. La coloration Nissl marque les corps cellulaires en se liant à l’ARN ribosomique, tandis que l’imagerie CARS cible la myéline riche en lipides par des signaux induits par laser. La superposition des images de fluorescence et de CARS fournit une vue détaillée des corps cellulaires et des axones myélinisés.

Protocole

Toutes les procédures impliquant des échantillons d’animaux ont été examinées et approuvées par le comité d’éthique animale approprié.

1.

1. Coloration Des coupes flottantes pour Nissl, pour visualiser les corps cellulaires (1:100), dans des milieux d’anticorps (milieux AB : 0,1 M tampon phosphate (PB : 50 mM KH2PO4, 150 mM Na2HPO4), 150 mM NaCl, 3 mM Triton-X, 1 % d’albumine sérique bovine (BSA)) pendant 30 min à température ambiante sur un agitateur de laboratoire standard.
   1. Protégez les sections de la lumière à l’aide d’une feuille d’aluminium et/ou d’un couvercle. Les longueurs d’onde de 550 nm ou moins sont compatibles avec l’imagerie CARS (Figure 1).
      REMARQUE : Bien que nous ne prévoyions pas que Triton-X ou d’autres réactifs aient un impact sur l’imagerie CARS des lipides, des contrôles supplémentaires avec des milieux d’anticorps spécifiques peuvent être justifiés.
2. POINT DE PAUSE : Stocker les sections flottantes (à l’abri de la lumière) dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) jusqu’à l’imagerie. Une fois sectionné, imagez les coupes cérébrales dans les 2 semaines.

2. REMARQUE

d’imagerie : La configuration laser CARS contient un laser à fibre qui fournit l’horloge de 80 MHz, et un laser OPO (oscillateur paramétrique optique) avec une portée accordable de 770 à 990 nm avec le faisceau Stokes fixé à 1031 nm, qui sont nécessaires pour collecter le signal CARS. Il y a une ouverture pour les deux faisceaux.

1. Avant d’amener des échantillons au microscope, allumez et réchauffez le laser CARS pendant au moins 1 h, alignez le laser CARS et Koehler l’optique du condenseur et le diaphragme du microscope pour l’imagerie CARS avant.REMARQUE : Cette étape est essentielle pour le bon fonctionnement de la microscopie CARS.
   1. Pour l’alignement spatial des deux faisceaux laser (pompe et pompes), accédez aux deux PSD (détecteurs sensibles à la position) internes via l’interface utilisateur graphique (GUI) laser CARS.
   2. Réalisez un alignement temporel en utilisant la fonction de retard dans l’interface graphique laser CARS, qui peut aider à chevaucher les impulsions des deux lasers (pompe et stokes) qui ont des dispersions différentes en raison de leurs longueurs d’onde différentes. Par conséquent, le chevauchement temporel et spatial des faisceaux de pompe et de pompage se fait avec l’entrée de l’utilisateur via l’interface graphique.
   3. Ajustez le périscope externe (les deux derniers miroirs de la configuration) pour centrer les deux lasers qui se chevauchent dans l’espace sur les miroirs de la tête de balayage du microscope.
   4. Pour une meilleure détection avancée des CARS sans balayage, assurez-vous que le condenseur est Koehler-ed (ce qui signifie que le condenseur est centré et focalisé sur le diaphragme pour obtenir un éclairage uniforme)
2. Pour l’imagerie confocale par immunofluorescence et l’imagerie CARS, équipez le laser CARS de détecteurs non désançonnés (NDD) CARS avant et épi, en incorporant un microscope confocal équipé de lasers visibles pour l’imagerie par fluorescence (Figure 2).
3. Placez les coupes dans une boîte de culture avec lamelle (pour la microscopie inversée), PBS pour éviter le dessèchement des tissus et un poids en verre pour maintenir les tissus près de la lamelle.
4. Prenez des piles z ou des images uniques avec un objectif à eau corrigé infrarouge 60X, 1,2 d’ouverture numérique (NA), qui sert à collecter le signal CARS dans la direction épi et à travers un condenseur NA 0,55 dans la direction avant pour imager des zones cérébrales telles que le noyau médial du corps trapézoïdal (MNTB).
   1. Prenez les images CARS à environ 600 mW pompe/sonde et 300 mW Stokes, en utilisant l’interface graphique laser CARS. Ces valeurs de puissance laser sont mesurées en interne par le système. La puissance des deux lasers à l’emplacement de l’échantillon est inférieure à 25 mW et sans danger pour l’échantillon de tissu.
   2. Superposez la pompe et les faisceaux Stokes dans l’espace et dans le temps. Réglez l’OPO à 797,2 nm. Cela donne une longueur d’onde CARS de 650 nm. En raison du niveau d’énergie plus élevé, le retour résultant à l’état fondamental est anti-Stokes (décalé vers le bleu) à l’excitation.
   3. Capturer le signal CARS dans des détecteurs épi ou directs non désbalayés à l’aide de filtres passe-bande (640-680 nm), suivi d’une détection séquentielle du marqueur d’immunofluorescence (dans ce cas, Nissl marqué par fluorescence). note: Le marqueur neuronal du soma de Nissl n’est pas capturé dans le filtre passe-bande CARS 640-680 nm, ce qui permet de combiner la fluorescence et l’imagerie CARS dans les images présentées ci-dessous.
   4. Utilisez ces paramètres pour un signal lipidique optimal afin d’imager sélectivement la myélinisation dans la région du cerveau. prudence: Protégez l’utilisateur du faisceau laser
5. Enregistrez les images sous forme de fichiers .oib, qui peuvent être importés dans un programme d’analyse d’images pour une quantification plus poussée (Figure 3).

Résultats

Figure 1 : L’imagerie CARS peut être combinée avec l’imagerie immunofluorescente. Les graphiques montrent que l’imagerie CARS se produit à 660/640 nm de spectre de signal rouge. Cette longueur d’onde est suffisamment éloignée de la...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Coloration :
AB Média :			1n 1 000 mL de Millipore H2O
Phosphate tamponné (PB) :
Phosphate de potassium Monobase	Sigma	P5655
Phosohate de Sodium Dibasic	Sigma	S7907
BSA (Albumine sérique bovine)	Sigma life science	A2153-100g
Chlorure de sodium	Fisher Chemical	s271-1
Triton X-100	Sigma - Aldrich	x100-500ml
Nissl 435/455	Invitrogen	N21479
CARS :
Filtre passe-bande APE picoemerald	laser Angewandte Physik & Elektronik GmbH
(420-520 nm)	Chroma Technology	HQ470/100m-2P
filtre passe-bande (500-530 nm)	Chroma Technology	HQ515/30m-2P
bandpass filtres (640-680 nm)	Chroma Technology	HQ660/40M-2P
Microscope confocal	Olympus	FV1000
Cut Pipette de transfert	Fisher	13-711-7M
dichroïque passe-long 565 nm	Chroma Technology	565dcxr
dichroïque passe-long 585 nm	Chroma Technology	585dcxr
passe-court dichroïque 750 nm	Chroma Technology	T750spxrxt
plat de culture à fond en verre	MatTek	P35G-0-10-C
poids du verre (tige boro 10 mm x 10 mm)	Allen Scientific Glass Inc
filtre d’émission passe-court multiphotonique 680 nm	Chroma Technology	ET680sp-2p8
PBS