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Toutes les procédures impliquant des échantillons d’animaux ont été examinées et approuvées par le comité d’éthique animale approprié.
1. Preparation
1. Taquinez chaque muscle en petits faisceaux de fibres d’environ 1 mm de large à l’aide de deux fines pinces dentelées.
REMARQUE : Il est crucial de manipuler les muscles très doucement avec la pince, sans force excessive, pour éviter d’endommager les tissus pendant les taquineries.
1. Dissociez le muscle tibial antérieur (TA) en 3 ou 4 faisceaux selon sa taille.
2. Pour le gastrocnémien (GA), séparez les parties médiale et latérale du muscle, puis dissociez chaque partie en 4-5 faisceaux en fonction de leur taille.
2. Immunomarge
1. Procédez à la perméabilisation des fibres musculaires : Transférez les faisceaux musculaires dans des plaques à 24 puits contenant 1 % (v/v) de Triton X-100 dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) et maintenez-les sous agitation douce (50 tr/min) pendant 1 h à RT ou 5 h à 4 °C.
REMARQUE : Divisez les faisceaux musculaires entre deux plaques pour procéder à des immuno-marquages séparés et minimiser le risque de confusion d’anticorps. Ne les divisez pas en plus de deux puits (1 puits/plaque) ; sinon, le nombre (N) de jonctions neuromusculaires (JNM) représentatives de leur état général dans le muscle analysé peut être insuffisant.
2. Laver les échantillons 3x pendant 5 min avec du PBS à RT et les incuber avec une solution bloquante composée de 4 % d’albumine sérique bovine (BSA) dans du PBS/Triton X-100 1 % pendant 4 h à 4 °C, sous une légère agitation (50 tr/min).
REMARQUE : N’utilisez pas de pompe d’aspiration pendant les étapes de lavage, mais aspirez plutôt la solution manuellement avec une pipette de 200 μL et des pointes de petite taille (la référence est indiquée dans le tableau des matériaux).
3. Incuber les échantillons pendant la nuit (O/N) à 4 °C sous une légère agitation (50 tr/min) avec la solution bloquante indiquée à l’étape 2.2 contenant des anticorps monoclonaux primaires contre le neurofilament M (NF-M, 2H3, dilution 1/200) ou la glycoprotéine 2 de la vésicule synaptique (SV2, dilution 1/200) pour marquer les terminaisons axonales présynaptiques ou les zones actives, respectivement.
4. Le lendemain, lavez les faisceaux musculaires 3x pendant 5 min dans du PBS sous agitation (50 tr/min).
1. Pour l’imagerie confocale : Incuber les faisceaux musculaires avec des anticorps anti-souris secondaires conjugués à un fluorophore électroluminescent rouge (F594) (dilution 1/500) et à de la α-bungarotoxine conjuguée à un fluorophore émetteur vert (α-BTX-F488) (dilution 1/1000) dans du PBS pendant 2 h à RT sous agitation (50 tr/min).
2. Pour l’imagerie par appauvrissement par émission stimulée (STED) : Incuber les faisceaux musculaires avec des anticorps anti-souris secondaires conjugués à un fluorophore émetteur vert (F488) (dilution 1/500) et à une α-bungarotoxine conjuguée à un fluorophore à émission rouge lointaine caractérisé par une photostabilité élevée (α-BTX-F633) (dilution 1/1000) dans PBS pendant 2 h à RT sous agitation (50 tr/min).
REMARQUE : N’exposez pas les échantillons à la lumière pendant l’incubation pour éviter le photoblanchiment.
5. Lavez les faisceaux musculaires étiquetés 3x pendant 5 min avec du PBS sous agitation (50 tr/min) et placez-les sur une lame avec un support de montage.
REMARQUE : Placez un maximum de 4 à 5 faisceaux musculaires par lame pour permettre l’étanchéité.
6. Ajoutez une lamelle en verre de grade #1.5 (ou #1.5H) (0.17 mm d’épaisseur) sur le dessus, et placez des aimants cylindriques des deux côtés de la diapositive pour appliquer une pression et aplatir les muscles.
7. Gardez les lames à l’abri de la lumière O/N à 4°C. Scellez les lames de façon permanente avec du vernis à ongles.
3. Acquisition d’images
1. Acquisitions par un microscope confocal
REMARQUE : Les images ont été collectées à l’aide d’un microscope confocal à balayage laser inversé à l’aide d’un objectif à immersion dans l’huile de magnitude 63x (HCX Plan Apo CS, ouverture numérique de 1,4 (NA)).
1. Pour une analyse à l’aveugle, qu’une personne non impliquée dans l’analyse code chaque diapositive avec un numéro donné. Rester à l’aveugle des groupes expérimentaux jusqu’à ce que la quantification des paramètres NMJ soit terminée pour tous les échantillons.
2. Lancez le logiciel du microscope en mode configuration > >machine.xlhw.
3. Placez la lame sur la platine du microscope et trouvez le plan d’observation dans l’échantillon en regardant sous l’éclairage de fluorescence à grand champ DAPI avec le jeu de filtres DAPI.
4.Cliquez sur Ouvrir le projet > Nouveaux projets> et créez un dossier pour stocker les acquisitions d’images.
REMARQUE : Créez un nouveau projet pour chaque NMJ afin de limiter la taille des dossiers et d’éviter les problèmes de mémoire de l’ordinateur.
5. Pour gérer les paramètres d’acquisition, cliquez sur la fenêtre de l’onglet Acquisition et réglez le sténopé confocal sur 1,0 unité Airy et la puissance laser pour optimiser les niveaux de gain et de décalage pour la fluorescence verte/F488 (α-BTX) à l’aide d’un laser de 488 nm sur la plaque d’extrémité qui doit être imagée (mode Live ON).
6. Ensuite, optimisez l’acquisition de la fluorescence rouge/F594 (NF-M ou SV2) à l’aide d’un laser adapté à l’observation F594. Dans cette étude, un laser de 552 nm a été utilisé (mode Live ON). Réglez le spectre d’émission de colorant avec les plages suivantes pour chaque laser : laser 405 (DAPI) de 414 à 483 nm, laser 488 (F488-α-BTX) de 506 à 531 nm et laser 552 (NFM/ SV2) de 622 à 650 nm.
7. Collectez des piles d’images de jonctions neuromusculaires dans chaque groupe expérimental avec les mêmes paramètres : taille d’image 1024 x 1024 pixels (73,7 x 73,7 μm) à une fréquence d’échantillonnage de 400 Hz, bidirectionnel X ON, facteur de zoom 2,5, taille de pas Z 0,5 μm en mode Z-Wide.
REMARQUE : Pour chaque NMJ, le nombre de tranches est défini pour acquérir la jonction entière. Les paramètres d’acquisition décrits ci-dessus remplissent le théorème d’échantillonnage de Nyquist-Shanon. Cependant, l’utilisateur peut cliquer sur le bouton Optimiser le format, présent sur tous les logiciels d’exploitation confocaux récents, pour s’assurer que la taille des pixels et le pas Z correspondent au taux d’échantillonnage idéal de Nyquist. Cette action permettra d’éviter les images sur-échantillonnées ou sous-échantillonnées, ce qui entraînera une perte de précision dans les mesures de volume.
8. Enregistrez le fichier original (.lif) ou les images Z-stack (.tif) dans un dossier dont le nom comprend le nom de code de la diapositive, le type de coloration et le numéro de la plaque d’extrémité.
REMARQUE : Collectez séquentiellement (pas simultanément) les balayages à l’aide des lasers 488 nm et 552 nm (F488 et F594) pour éviter la diaphonie de la fluorescence F488 dans le canal F594 et vice versa (saignement). Le trajet du faisceau peut être configuré avec l’assistant de colorant dans le logiciel du microscope.
9. Passez à la diapositive codée suivante et répétez les étapes 3.1.3 à 3.1.8 pour chaque NMJ.
10. À la fin de la session, cliquez sur Ouvrir dans 3D Viewer et choisissez un représentant NMJ d’un groupe expérimental pour visualiser l’étiquetage 3D.
REMARQUE : Ce mode d’affichage permet de vérifier que les paramètres d’acquisition étaient corrects.
11. Fermez le logiciel du microscope, nettoyez les objectifs avec des tissus d’objectif, puis éteignez le système.
2. Acquisitions par microscopie STED
REMARQUE : Les images ont été collectées à l’aide d’un microscope confocal à balayage laser inversé équipé d’un Sted à 775 nm à l’aide d’un objectif à immersion dans l’huile 100x (HC PL APO CS2 1.4 NA).
1. Pour une analyse à l’aveugle, qu’une personne non impliquée dans l’analyse code chaque diapositive avec un numéro donné. Rester à l’aveugle des groupes expérimentaux jusqu’à ce que la quantification des paramètres NMJ soit terminée pour tous les échantillons.
2. Lancez le logiciel du microscope en mode configuration > machine.xlhw et STED ON.
3. Cliquez sur Ouvrir le projet > Nouveaux projets pour créer un dossier pour stocker les acquisitions d’images.
>REMARQUE : Générez un nouveau dossier pour chaque diapositive afin de limiter la taille du dossier et d’éviter les problèmes de mémoire de l’ordinateur.
4. Placez la lame sur la platine du microscope et visualisez-la sous un éclairage de fluorescence à grand champ à l’aide du laser 488 nm pour trouver le plan d’observation dans l’échantillon.
5. Recherchez un NMJ marqué avec une coloration de neurofilament M (NFM) ou SV2 à l’aide du laser 488 nm avec une détection spectrale de 506-531 nm.
6. Lorsqu’un NMJ a été identifié, cliquez sur Activer STED et commencez à acquérir des images dans une région contenant plusieurs plis jonctionnels à l’aide du laser 635 nm avec une détection spectrale de 640-750 nm.
>REMARQUE : Faites attention à la table de recherche de saturation lors de l’acquisition de l’image et cliquez sur le bouton Quick LUT pour éviter la surexposition (valeurs de gris >255 ; pour 8 bits).
7. Collectez les images de chaque groupe expérimental avec les mêmes paramètres : taille de l’image 2048 x 2048 pixels (38,75 x 38,75 μm) à une fréquence d’échantillonnage de 400 Hz.
REMARQUE : La puissance du laser d’épuisement (STED) est réglée à 65 %.
8. Enregistrez les images avec un nom de fichier qui inclut le code de la diapositive.
REMARQUE : Il est possible de cliquer sur Format XY optimisé : Définir le format pour obtenir le meilleur réglage d’acquisition avec l’imagerie STED.
9. Passez à la diapositive codée suivante et répétez les étapes 3.2.3-3.2.8. Répétez cette procédure pour toutes les diapositives.
10. À la fin de la session de microscopie STED, transférez les fichiers image sur un autre ordinateur et enregistrez les fichiers originaux (.lif) sur un disque externe ou un serveur.
11. Éteignez le logiciel du microscope, nettoyez les objectifs avec des tissus d’objectif, puis éteignez le système.