Administration d’un colorant fluorescent dans l’espace sous-rétinien d’une souris

Résumé

Source : Parikh, S., et al. Une méthode d’injection alternative et validée pour accéder à l’espace sous-rétinien via une approche transclérale postérieure. J. Vis. Exp. (2016)

Cette vidéo montre la procédure d’administration d’un colorant fluorescent dans l’espace sous-rétinien d’une souris. Le processus consiste à anesthésier la souris, à préparer l’œil, à faire des incisions précises pour accéder à l’espace sous-rétinien et à injecter le colorant pour créer un décollement de rétine contrôlé. Cette technique permet une administration ciblée du colorant, ce qui permet une imagerie et une analyse détaillées des structures rétiniennes.

Protocole

Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.

Animaux : Souris sauvages de type C57Bl/6J élevées à l’Université de Californie à Los Angeles (UCLA). Tous les animaux étaient âgés de 11 à 17 semaines et comprenaient des souris mâles et femelles. Toutes les souris ont été hébergées en groupe, maintenues dans un cycle lumière/obscurité de 12:12 avec de la nourriture et de l’eau à volonté.

REMARQUE : Tous les médicaments et agents injectables sont de qualité USP (United States Pharmacopeia).

1. Préparation chirurgicale

1. Anesthésier la souris avec une injection intrapéritonéale de 100 mg/kg de kétamine et de 8 mg/kg de xylazine dans un mélange salin. Administrez l’anesthésie à une profondeur telle que la souris n’ait pas de pincement des orteils ou de réflexes tactiles cornéens.
2. Maintenez la température corporelle à 37,0 °C à l’aide d’un coussin d’eau en circulation.
3. Dilater les pupilles avec des gouttes ophtalmiques à 2,5 % de phényléphrine et tailler les moustaches pour faciliter la visualisation. Les moustaches fournissent un apport sensoriel important à la souris ; Par conséquent, la coupe des moustaches ne doit enlever que la partie qui bloque l’accès dégagé à l’œil, et non à la base de la moustache. D’après notre expérience, les souris montrent une récupération normale après cette procédure. Appliquez des gouttes ophtalmiques de méthylcellulose pour prévenir la sécheresse et minimiser les cataractes transitoires induites par l’anesthésie.
4. Stérilisez les instruments avant la chirurgie (c.-à-d. la bétadine et l’éthanol ou les billes chaudes).
5. Préparez de la fluorescéine diluée (0,01 % avec une solution saline à 0,9 %) dans un environnement stérile (c.-à-d. une enceinte de biosécurité) si la visualisation peut être effectuée (voir la section 3 ci-dessous).

2. Préparation du site d’injection

1. Préparez une seringue (p. ex., seringue de 5 μl) avec le volume d’injection approprié (p. ex., 0,3 à 1,0 μl).
2. Positionnez la souris de manière à ce que l’œil soit tourné vers le haut et clairement visible dans le microscope de dissection.
3. Pincez doucement la conjonctive temporale à l’aide d’une pince à pointe fine. Faites une incision circonférentielle d’environ 90 degrés à l’aide de ciseaux Vannas incurvés.
4. Répétez l’étape 2.3 avec la capsule de Tenon sous-jacente.
5. Réséquez le tissu conjonctif environnant à l’aide d’une pince à pointe fine tout en faisant pivoter le globe par voie nasale. Travaillez vers le site d’injection à environ 0,5 mm temporal du nerf optique. Faites très attention à ne pas perturber le sinus rétro-orbitaire.

3. Sclérotomie et injection sous-rétinienne

REMARQUE : Il est recommandé d’utiliser l’injection de fluorescéine à 0,01 % dans une solution saline à 0,9 % pour faciliter la visualisation pendant l’apprentissage de cette procédure. La distribution topographique de la fluorescéine peut être documentée efficacement par l’imagerie du fond d’œil (voir section 4 ci-dessous).

1. Faites une petite incision sclérale au site d’injection en grattant doucement l’œilleton avec une lame ophtalmique à 22,5 degrés. Cette incision ne doit être assez grande que pour permettre à la pointe de l’aiguille de passer à travers la sclère.
2. Insérez l’aiguille biseautée 33 G (inclinée de 5 à 10° dans la sclérotomie, le biseau étant tourné vers l’écran et incliné parallèlement à la rétine. Injectez le volume souhaité (par exemple, 0,3 à 1,0 μl de fluorescéine à 0,01 % à des fins d’apprentissage).
   REMARQUE : Maintenez la stérilité de la seringue en la nettoyant soigneusement avec des lavages successifs d’un solvant approprié et de l’eau DI avant chaque injection.
3. Appuyez lentement sur le piston (sur ~ 3 secondes) sans bouger l’aiguille et avec une pression uniforme.
   REMARQUE : Lorsque l’aiguille se trouve dans l’espace sous-rétinien, une légère résistance se fera sentir lors de l’enfoncement du piston. Il n’y aura pas ou peu de résistance si l’aiguille perfore la rétine, et une résistance élevée si l’aiguille ne pénètre pas dans la sclérotique ou l’épithélium pigmentaire rétinien (EPR).
4. Attendez quelques secondes avant de retirer l’aiguille pour minimiser le reflux.
5. Rincez l’œil avec une solution saline tamponnée stérile et assurez-vous que l’œil a pivoté pour revenir à sa position normale.

4. Évaluation du décollement de la rétine par tomographie par cohérence optique (OCT) et imagerie du fond

1. d’œil Effectuez une imagerie OCT immédiatement après l’injection pour évaluer la qualité de l’injection et à des moments appropriés après l’injection, au besoin, pour évaluer la structure rétinienne.
   1. Ajustez et alignez l’image OCT pour cibler le site d’injection. Le site d’injection doit être médian et à 0,5 mm temporal de la tête du nerf optique. Répétez l’opération si nécessaire si le détachement est hors du cadre ou si son centrage n’est pas optimal.
2. Visualisez le décollement de la rétine et la zone d’injection du colorant avec l’imagerie du fond d’œil en face.
   REMARQUE : Si un système d’imagerie OCT n’est pas disponible, l’injection d’une petite quantité de fluorescéine avec un vecteur pour la pratique permettra la visualisation avec n’importe quelle caméra de fond d’œil qui effectue une angiographie à la fluorescéine en utilisant les mêmes longueurs d’onde d’excitation et les mêmes filtres bloquants. Des zones localisées d’hyperfluorescence apparaîtront sous le système vasculaire, et le système vasculaire aura des limites nettes et distinctes si l’espace sous-rétinien est correctement ciblé. Le bord de la bulle de l’injection sera délimité par le passage de l’hyperfluorescence à l’hypofluorescence. Plusieurs instruments offrent cette capacité à la souris ; L’instrumentation utilisée ici est décrite ailleurs.

5. Soins postopératoires

1. Appliquez une couche épaisse de crème ophtalmique antibiotique triple sur la surface cornéenne de l’œil injecté.
2. Placez les souris dans des cages solitaires propres pour les récupérer. Ne combinez pas de souris qui ont subi une intervention chirurgicale avant qu’elles ne soient complètement rétablies.
3. Surveillez la respiration et la température pendant la récupération de l’anesthésie. Surveillez les animaux jusqu’à ce qu’ils puissent maintenir une décubitus sternal.
4. Effectuer une surveillance et un traitement postopératoires supplémentaires appropriés, y compris une injection sous-cutanée de carprofène (5 mg/kg) pour la gestion de la douleur post-chirurgicale.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Hamilton Model 62 RN SYR	Hamilton	87942	Seringue x 1
aiguille Hamilton 33 G, 1.0", 20 DEG, point 3 (acier inoxydable 304)	Hamilton	7803-05	Aiguilles x 6
Ciseaux courbes Vannas	Ted Pella, INC.	1347	Lame de 5 mm
Couteau de microchirurgie à 22,5 degrés	Wilson Ophthalmic Corp.	91204
Ketaject	Phoenix	NDC 57319-609-02	Kétamine
Anased	Lloyd Laboratories	NDC 61311-482-10	Xylazine
Fluorescéine 10 % AK-Fluor	Akorn	NDC 17478-253-10	100 mg/ml
0,9 % Saline USP	Hospira	NDC 0409-4888-50	0,9 % NaCl
Pommade antibiotique	Akorn	NDC 17478-235-35
Pompe de circulation d’eau ophtalmique	Gaymar	TP-500 T/Pump	P/N 07999-000
sd-OCT	Bioptigen	R-Series	Commercial
Fundus	Camera Phoenix Research Laboratories	MICRON III
Pince à épiler Type 3	Ted Pella, INC.	5385-3SU
2,5 % phényléphrine	Paragon BioTeck	NDC 42702-102-15	Hypromellose ophtalmique
2,5 %	Goniovisc	AX0401	Gouttes ophtalmiques en méthylcellulose
(rinçage)	Bausch & Lomb		solution saline
	Zeiss	Stemi 2000
Microscope Source lumineuse	Fostec	P/N 20520	Source lumineuse

Microscope à