Summary
שיטה פשוטה, מהירה לקביעת פוטנציאל saccharification של מספר גדול של דגימות ביומסה הצמח מתואר. הפלטפורמה אוטומטיים לניתוח זה כרוך בהכנה של ביומסה הצמח לניתוח ב 96 צלחות היטב את הביצועים הבאים של הידרוליזה המקדים, וכימות של סוכרים שוחרר.
Abstract
סוכרים שמרכיבים ביומסה במפעל lignocellulosic יכול להיות שבור למטה כדי לייצר מגוון של סוכרים, כי לאחר מכן ניתן להשתמש הקמת biorefinery. אלה חומרי הגלם יהווה פלטפורמה התעשייה החדש, שהוא גם בר קיימא פחמן ניטרלי, כדי להחליף את התלות הנוכחי על דלק מאובנים. סרבנות על הדקונסטרוקציה שנצפתה חומרים lignocellulosic מופק על ידי מספר מאפיינים מהותיים של קירות תא הצמח. תאית הקריסטל מוטבע סוכרים כגון מטריקס ו xylans arabinoxylans, ואת המבנה כולו עטוף על ידי פנוליות הפולימר ליגנין, שהוא גם קשה לעיכול 1. כדי לשפר את העיכול של חומרי הצמח אנחנו צריכים לגלות את צווארי הבקבוק העיקריים saccharification של קירות התא וגם מוטציה מסך אוכלוסיות הרבייה להעריך את משונות saccharification 2. משימות אלה דורשות גישה תפוקה גבוהה וכאן אנו מציגים פלטפורמה אנליטית כי ניתן לבצע ניתוח saccharification בפורמט 96-היטב צלחת. פלטפורמה זו פותחה כדי לאפשר את הקרנת העיכול lignocellulose של אוכלוסיות גדולות של מיני צמחים שונים. יש לנו scaled למטה הכרכים תגובה עבור המקדים עדין, הידרוליזה אנזימטית חלקית ונחישות סוכר, כדי לאפשר במספרים גדולים כדי להעריך במהירות מערכת אוטומטית.
זו פלטפורמה אוטומטית עובדת עם כמויות מיליגרם של ביומסה, ביצוע כרסום כדור בתנאים מבוקרים כדי לצמצם את חומרי צמח לגודל החלקיקים סטנדרטית באופן לשחזור. לאחר הדגימות הם הקרקע, הרובוט עיצוב אוטומטי dispenses הסכומים שצוינו נרשם חומר לתוך בארות המקביל צלחת 96 באר עמוקה (איור 1). בדרך כלל, אנו מחלקים את אותו חומר תוך 4 בארות יש 4 משכפל לניתוח. לאחר הצלחות מלאים בחומר צמח בפריסה הרצויה, הם מועברים באופן ידני לתחנת טיפול נוזלי (איור 2). בתחנה זו הדגימות כפופים המקדים קלה עם חומצה או לדלל או אלקליין מודגרות בטמפרטורות של עד 90 ° C. הפתרון המקדים יוסר לאחר מכן את הדגימות שטפה עם חיץ להחזיר אותם pH מתאים הידרוליזה. הדגימות מודגרת מכן בתערובת אנזים לאורך זמן משתנה של 50 ° C. Aliquot נלקח hydrolyzate לבין הפחתת סוכרים נקבעים באופן אוטומטי על ידי שיטת colorimetric MBTH.
Protocol
1. הכנת הדגימות
בדרך כלל אנחנו עובדים עם נובעת עשבוניים או צמחים עציים. במקרה של חומרים עשבוניים אנו גדלים הצמחים לפדיון, לאחר התפתחות הזרע שאנו אוספים נובעת יבש פעם הזדקנות תושלם. נובעת הן קצוץ לתוך 4 חלקים מ"מ להציב 2 בקבוקוני מ"ל עם שלושה כדורים כרסום. במקרה של חומרים וודי, הדגימות הם הקרקע נסורת גס עם קובץ עץ כמובן ולאחר מכן להציב טחנת כדור לעיבוד נוסף.
דגימות ממוקמות במעמד בתוך שחיקה / עיצוב התחנה (איור 1). תחנה זו ברצף טוחן, מערבב, ושוקל כל המדגם. מספר החזרות הדרוש לדגימה היא הוקמה על ידי בדיקת חומר הקרקע בסדרה של ניסויים ראשוניים בהם השתנות פנימי בגודל חלקיק מסוים נקבע. 2 בקבוקוני מ"ל הם דקרו בתחתית ואת החומרים לוותר על הרטט של הבקבוקון על כן נבחר. הזרוע רוטט נשלטת על ידי משוב מן האיזון המאפשר מחלק מדויקת של אבקה. הרובוט dispenses 4 מ"ג / גם בניתוח רגיל 4 חזרות יש צורך ברוב המקרים. זה מאפשר 20 דגימות צמח / צלחת להיות מנותח.
2. Pretreatment
לאחר דגימות מעוצבות, הצלחות 96-מעובדים היטב על ידי מערכת טיפול אוטומטי נוזלי (איור 2). הנה המקדים קלה מתבצע על ידי הוספת חומרים צמח 350 μL של חומצה או אלקליין פתרונות וחימום את הצלחת על גוש מותאם. כדי למנוע אידוי במהלך הניתוח, 96 צלחות חתומות היטב עם מאט סיליקון. הטמפרטורה וזמן טיפול מקדים יכול להיות שונה על פי החומרים הנלמד. הטמפרטורה המקסימלית, לעומת זאת, היא 100 ° C. הליך חלופי לבדיקה pretreatments קשים היא pretreat החומרים מעל הקו ולבטל את pretreatmet מן התהליך.
3. הידרוליזה
- אחרי החומרים הם pretreated, הרובוט מסיר אוטומטית את הפתרון המקדים, ושוטף, כל הבארות, 5 פעמים עם 850 μL הצפת Acetate 25 מ"מ. שטיפות מתבצעת על ידי הוספת מאגר לפתרון לפני הטיפול, ולאחר מכן הסרת 50% מהנפח הכולל לאחר המאפשר מוצקים במדגם להתיישב. גובה השאיפה מוגדר מחצית מסת הנוזל, כדי למנוע aspirating מוצקים מתחתית הבאר, יש הפסד זניח של מוצקים באמצעות גישה זו. אחרי אלו רוחץ את ה-pH בבאר הוא 4.5 ואת החומר מוכן הידרוליזה אנזימטית.
- תערובת המכילה אנזים פתרון של cellulases ו hemicellulases נוסף על ידי הרובוט. לתוך כל טוב, 850 μL של תערובת האנזים הוא חילק את צלחת מועבר לתוך 50 ° C רועד חממה. הידרוליזה הסטנדרטי הוא ביצע עבור 8 שעות, אבל הפעם יכול להיות מותאם לצורך הניסוי. טעינת אנזים הסטנדרטית המשמשת עבור עשבים הוא 7 FPU / g של חומר.
4. איתור של הפחתת סוכרים
קביעת הפחתת סוכרים שוחרר לאחר הידרוליזה בוצעה באמצעות שונה 3-methyl-2-benzothiazolinone hydrozone (MTBH) שיטה 3. MBTH נבחרה השיטה המתאימה ביותר כי זה היה הכי קל להפוך את רגישים פחות להפרעות תרכובות כגון חלבונים. שינינו את השיטה רגישה מאוד לשימוש בפלטפורמת רובוטית, כך שזה יכול לכמת במדויק את ריכוזי סוכרים נוכח hydrolysates ביומסה, עם נפח סופי של 250 μL אשר מתאים צלחת תקן 96 אופטי טוב. כל הפעולות הבאות נעשות באופן אוטומטי ושלושה קביעות עצמאית של הפחתת סוכרים בוצעו עבור כל תגובה saccharification.
- 30 μL של hydrolyzate נלקח הצלחת היטב עמוקה מהולה μL 45 של 25 חיץ נתרן אצטט מ"מ צלחת עקפה 96 PCR היטב.
- 25 μL של NaOH 1N ו - 50 μl של תמיסה המכילה 0.43 מ"ג / מ"ל MBTH ו 0.14 מ"ג / מ"ל DTT נוספו.
- לאחר ערבוב, הצלחת PCR היה מחומם על 60 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות ב thermocycler או מכשיר דומה אשר מספקת בדיוק את אותה כמות של חום לכל 96 בארות.
- התגובה וכתוצאה מכך הועבר צלחת אופטי.
- הוסף 100 μl של מגיב oxidising (0.2% FeNH4 (SO4) 2, Sulfamic Acid 0.2% ו 0.1% HCl). מערבבים היטב ולהשאיר לפתח לפחות 1 ח
- הצלחת כל צריך להכיל גם תגובות תקן של 50 nmol, 100 ו - 150 nmol גלוקוז nmol. הצלחות אופטיים לקרוא 620 ננומטר.
5. נציג תוצאות:
דוגמאות לסוגים שונים של ניתוחים מוצגות באיור 3 ו -4. כל התוצאות התקבלו באמצעות פלטפורמה אוטומטית. איור 3 מחדשמציג את העלייה הפחתת סוכרים שפורסמו על ידי 8 incubations h מ צפצפה הקרקע עם כמויות גדלות והולכות של אנזימים cellulolytic. איור 4 מציג את ההשפעות של חומצה המקדים אלקליין על דגימות צפצפה. טיפול מקדים NaOH הוא יעיל יותר כי המקדים בדילול H2SO4 בקידום שחרורו של סוכרים במהלך הידרוליזה. הסכום של סוכרים נמדד לאחר הידרוליזה פוחתת כאשר המקדים מבוצע באמצעות ריכוזים גבוהים יותר מאשר NaOH 1M.
באיור 1. לתחנת רובוטית עבור שחיקה 96 עיצוב טוב של ביומסה
איור 2. לתחנת טיפול נוזלי עבור ניתוח תפוקה גבוהה saccharification
איור 3. השפעת מקדמי אנזים שונה על שחרורו של הפחתת שווי סוכר ממדגמים צפצפה
איור 4. השפעת pretreatments שונים saccharification של דגימות צפצפה. סוכרים א שוחרר לאחר pretreament עם אחוזים שונים של H2SO4 על 90 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות. B. סוכרים שוחרר לאחר pretreatments NaOH בטמפרטורת הזמן אותו מאשר המקדים את החומצה .
Disclosures
אין לנו שום דבר לגלות.
Acknowledgments
המחברים מבקשים להודות Viksø-נילסן (Novozymes) על המתנה של האנזימים cellulolytic. עבודה זו מומנה על ידי חידוש FP7 ועל ידי פרויקטים BBSRC BB/G016178 ו BB/G016194.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Grinding & weighing robot | Labman Automation | ||
| 2 ml micro tube with caps | Sarstedt Ltd | 72.694 | |
| 5 mm stainless steel beads | Qiagen | 69989 | |
| 1.2ml Abgene square well storage plates | Fisher Scientific | TUL-050-050C | |
| Whatman cap mat for 96 square well plates | Fisher Scientific | 7704-0104 | |
| Liquid hanling robot | Tecan Group Ltd. | Freedom Evo 200 | |
| Sulphuric acid | Fisher Scientific | S/9231/PB17 | |
| Sodium hydroxide | Fisher Scientific | BPE359-500 | |
| Sodium acetate | Sigma-Aldrich | S8750-500G | |
| Acetic acid | Fisher Scientific | A/0420/PB17 | |
| Novozyme 188 | Novozyme | DCN00214 | |
| Celluclast 1.5L | Novozyme | CCN03122 | |
| 96 well PCR full skirt plates | Sarstedt Ltd | 72.1980.202 | |
| D-Glucose | Fisher Scientific | G/0450/53 | |
| 3-Methyl-2-benzothiazolinone hydrazone hydrochloride hydrate | Sigma-Aldrich | 129739-25G | |
| DL-dithiothreitol | Sigma-Aldrich | D9163-1G | |
| Corning microplate 96 well flat bottom | Fisher Scientific | TKT-521-050H | |
| Ammonium iron (III) sulfate dodecahydrate | Sigma-Aldrich | F1668-250G | |
| Sulfamic acid | Sigma-Aldrich | 242772-500G | |
| Hydrochloric acid | Fisher Scientific | 12462-0026 |
References
- Carpita, N. C. Structure and Biogenesis of the Cell Walls of Grasses. Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol. 47, 445-476 (1996).
- Gomez, L. D., Steele-King, C. G., McQueen-Mason, S. J. Sustainable liquid biofuels from biomass: the writing's on the walls. New Phytol. 178, 473-485 (2008).
- Anthon, G. E., Barrett, D. M. Determination of reducing sugars with 3-methyl-2-benzothiazolinonehydrazone. Anal Biochem. 305, 287-289 (2002).
- Gomez, L. D., Whitehead, C., Barakate, A., Halpin, C., McQueen-Mason, S. J. Automated saccharification assay for determination of digestibility in plant materials. Biotechnol Biofuels. 3, 23-23 (2010).
