Induction optogénétique de la dépression à long terme pour supprimer le comportement de recherche de narcotiques chez le rat

Résumé

Source : Rich, M. T., et al. Utilisation de l’optogénétique pour inverser la neuroplasticité et inhiber la recherche de cocaïne chez les rats. J. Vis. Exp. (2021)

Cette vidéo démontre l’utilisation de l’optogénétique pour induire une dépression à long terme (DLT) au niveau des synapses du noyau géniculé médial à l’amygdale latérale (MGN-LA), affaiblissant le comportement de recherche de narcotiques induit par des signaux dans un modèle de rat. Le rat, implanté chirurgicalement avec des fibres optiques et transduit viralement pour exprimer des canaux ioniques sensibles à la lumière, subit une stimulation optogénétique avec des impulsions optiques à basse fréquence, déclenchant la libération de neurotransmetteurs et l’affaiblissement synaptique. Ce processus réduit la transmission synaptique du MGN-LA par l’internalisation des récepteurs des neurotransmetteurs, perturbant ainsi l’association entre les signaux et le comportement de recherche de drogues.

Protocole

Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.

1. Cathétérisme intraveineux chez les rongeurs, administration de virus et implantation de fibres optiques

1. Préparez les animaux à la chirurgie.
   1. Anesthésier complètement les rats avec l’anesthésique de leur choix selon les directives de l’établissement. Une option est le chlorhydrate de kétamine (87,5-100 mg/kg, intramusculaire [i.m.]) et le chlorhydrate de xylazine (5 mg/kg, i.m.). Assurez-vous que le rat est complètement anesthésié en vérifiant s’il n’y a pas de réflexe de pincement de l’orteil.
      ATTENTION : La kétamine est une substance contrôlée qui doit être manipulée conformément aux directives institutionnelles.
      REMARQUE : Les injections intramusculaires d’anesthésiques sont utilisées dans cette étude car elles produisent une induction d’anesthésie plus rapide et plus fiable que l’injection intrapéritonéale. Surveiller en permanence la respiration et la réactivité du rat et lui fournir un soutien thermique tout au long de la chirurgie.
   2. Rasez une grande partie du dos du rat (le haut du dos, juste au-dessus des omoplates jusqu’au milieu du dos), ainsi que la zone du cou sous le membre antérieur droit et le cuir chevelu.
   3. Placez le rat dans la zone chirurgicale et appliquez du puralube (larmes artificielles) sur les yeux. Injecter un volume de poids corporel de carprofène (analgésique) par voie sous-cutanée (sous-cutanée [s.c.]) à travers la peau du haut du dos, puis injecter 5 mL de solution de Lactate Ringer s.c. à travers la peau du bas du dos.
   4. Désinfectez tous les sites chirurgicaux en mouillant un morceau de gaze stérile avec de la bétadine et en l’essuyant sur la zone chirurgicale rasée à l’aide d’un mouvement circulaire. Répétez ensuite le processus avec de l’éthanol à 70 %. Répétez ce cycle alternatif trois fois.
2. Effectuez l’implantation d’un cathéter intraveineux conformément aux protocoles précédemment publiés.
   REMARQUE : Un champ chirurgical n’est pas utilisé lors de cette chirurgie pour éviter l’irritation lors de l’implantation du cathéter. Stérilisez tous les instruments et équipements avant utilisation. Utilisez des gants stériles et changez les gants si vous entrez en contact avec une surface non stérile.
3. Immédiatement après l’implantation du cathéter, fixez le rat dans un cadre stéréotaxique pour effectuer des injections de virus adéno-associés (AAV).
   1. Administre une injection sous-cutanée (s.c.) de 2 % de lidocaïne (0,2-0,3 mL) sur le cuir chevelu en tant qu’anesthésique local.
      REMARQUE : L’anesthésique local n’est pas utilisé lors de l’implantation du cathéter intraveineux pour éviter les altérations des résultats chirurgicaux.
   2. Connectez une canule d’injection en acier inoxydable de calibre 26 à une seringue Hamilton remplie de 1 μL de solution concentrée d’AAV : soit AAV5-hSyn-tdTomato, soit AAV5-hSyn-oChIEF-tdTomato
      REMARQUE : oChIEF est une variante de la canalrhodopsine sensible à la lumière bleue (ChR2), qui peut répondre à une large gamme de fréquences, et a donc une utilité pour les expériences de dépression à long terme (LTD) à basse fréquence discutées dans ce protocole, mais aussi pour des expériences de potentialisation à long terme (LTP) à haute fréquence. La construction oChIEF a été donnée par le Dr Roger Tsien et traitée pour l’emballage et la purification par le Duke Viral Vector Core. Il faut au moins 3 à 4 semaines entre le jour de l’injection et le jour de l’induction de la DLT pour permettre une expression optimale du virus dans le noyau géniculé médial des terminaisons axonales du thalamus (MGN).
      ATTENTION : En général, l’AAV est considéré comme un organisme de niveau de biosécurité 1 (BSL-1), avec un faible risque d’auto-infection, à moins qu’un virus auxiliaire ne soit utilisé dans sa production. Son utilisation nécessite l’approbation du Comité institutionnel de protection et d’utilisation des animaux (IACUC), et un équipement de protection individuelle (EPI) approprié doit être utilisé en tout temps conformément aux directives de l’établissement pour limiter l’exposition inutile.
   3. À l’aide d’un scalpel, faites une incision de 0,5 mm de l’avant vers l’arrière du crâne et retirez le tissu sus-jacent pour exposer la surface du crâne.
   4. Nivelez la tête du rat dans l’axe antérieur/postérieur et zéro coordonnée stéréotaxique à bregma.
   5. Percez trois petits trous à travers le crâne à l’aide d’un outil Dremel équipé d’un petit foret. À l’aide d’un tournevis, fixez fermement les vis en acier inoxydable (M2x4 965-A2) en place.
      REMARQUE : Des vis sont nécessaires pour lier correctement le ciment dentaire et créer des embouts robustes et durables. La position des vis doit être répartie sur l’axe antéro-postérieur du crâne et loin du site d’injection de l’AAV.
   6. Percer des trous bilatéraux pour l’injection d’AAV sur la base des coordonnées de l’Atlas du cerveau du rat (Watson et Paxinos) pour la partie médiale du noyau géniculé médial (MGN) ; en mm à partir du bregma, antéropostérieur (AP) : -5,4 ; médiolatéral (ML) : ±3,0 ; dorso-ventral (DV) : -6,6. Abaissez lentement les canules d’injection (4 mm/min) jusqu’à ce qu’elles soient positionnées dans le MGN. Injecter une solution concentrée d’AAV à un débit de 0,1 μL/min.
   7. Laissez la canule d’injection en place pendant 5 minutes après la fin des perfusions pour permettre la diffusion loin de la canule, puis retirez lentement la canule du cerveau.
4. Immédiatement après les injections de virus, continuez à implanter des fibres optiques ciblant les terminaux MGN-LA.
   1. Utilisez un outil Dremel pour percer des trous bilatéraux pour les implants de fibres optiques ciblant l’amygdale latérale (en mm à partir de bregma, AP : -3.0 ; ML ±5.1).
   2. À l’aide d’une pince, saisissez la virole de l’implant de fibre optique et fixez-la aux adaptateurs stéréotaxiques afin qu’ils soient solidement maintenus en place.
   3. Abaissez lentement les fibres à une vitesse de 2 mm/min, jusqu’à ce que l’extrémité de la fibre se trouve dans la partie dorsale de l’AL (dorso-ventrale [DV] : -7,9 mm).
   4. Fixez d’abord les embouts sur le crâne à l’aide d’une fine couche d’adhésif instantané Loctite, puis de ciment dentaire, et couvrez les embouts avec des manchons de virole de 1,25 mm de diamètre et des cache-poussière.
      REMARQUE : Le choix de l’adhésif pour fixer les embouts au crâne doit être approuvé par le comité local ou institutionnel de soin et d’utilisation des animaux. La loctite est utilisée pour cette étude pour fixer de manière fiable les viroles au crâne après essais et erreurs avec plusieurs adhésifs ; Cependant, des alternatives disponibles peuvent être envisagées.
5. Après les interventions chirurgicales, les rats sont logés individuellement et leur donnent libre accès à de la nourriture et à de l’eau. Fournir des soins postopératoires conformes aux directives de l’établissement. Rincez quotidiennement les cathéters avec une solution saline contenant de la gentamicine (5 mg/mL) et de l’héparine (30 USP/mL) pour maintenir la perméabilité. Au moins 5 jours après l’opération et 24 h avant le début des expériences comportementales, la nourriture limite les rats à ~90 % de leur poids d’alimentation libre.

2. Auto-administration de cocaïne chez les rongeurs et extinction du levier instrumental

REMARQUE : Toutes les procédures comportementales sont menées dans des chambres de conditionnement opérantes standard, équipées de deux leviers rétractables sur un mur, d’une lumière de stimulus au-dessus de chaque levier, d’un générateur de tonalités, d’une lumière de maison et d’une pompe à perfusion.

1. Soumettez des rats à des séances d’auto-administration quotidiennes de cocaïne (2 mg/mL) quotidiennes pendant 1 h dans le cadre d’un programme de renforcement à ratio fixe.
   1. Placez les rats dans une chambre opérante chaque jour et laissez-les appuyer sur l’effet de levier. Une pression sur le « levier actif » désigné (contrebalancé entre les leviers gauche et droit) donne lieu à une perfusion de cocaïne (1,0 mg/kg/perfusion) et à une présentation en 10 secondes d’un signal composé de lumière et de tonalité. Une pression sur le « levier inactif » désigné n’a pas d’effets programmés.
   2. Continuez les expériences d’auto-administration pendant au moins 10 jours et jusqu’à ce que les rats réussissent à obtenir au moins 8 perfusions par jour pendant 3 jours consécutifs. Le fait de ne pas atteindre les critères d’acquisition au 20e jour entraîne l’exclusion de l’étude.
2. Une fois que les critères d’acquisition sont remplis avec succès, soumettez les rats à 1 h de séances d’extinction instrumentale pendant 6-10 d.
   1. Placez les rats dans des chambres opérantes et permettez-leur d’appuyer librement. Cependant, les réponses sur les leviers actifs et inactifs n’ont pas de conséquences programmées.
   2. Demandez aux rats de poursuivre l’extinction instrumentale quotidiennement jusqu’à ce qu’une moyenne de < 25 pressions de levier sur deux jours consécutifs se produise.

3. Induction optogénétique in vivo de LTD

REMARQUE : Les expériences d’inhibition optogénétique ont lieu 24 h après le dernier jour de l’extinction instrumentale.

1. Connectez les cordons de raccordement à une diode laser bleue de 473 nm via un joint rotatif suspendu au-dessus d’une cage de logement de rongeur propre et standard avec le couvercle retiré. Cette configuration permet aux rongeurs de se déplacer librement dans la cage pendant la stimulation optogénétique.
2. Allumez la diode laser conformément au mode d’emploi et connectez-vous à un générateur d’impulsions. Ajustez les paramètres de sorte que, lorsqu’il est allumé, le rat reçoive 900 impulsions lumineuses de 2 ms à 1 Hz.
   ATTENTION : Une protection oculaire appropriée doit être utilisée à tout moment lors de l’utilisation du laser.
3. Mesurez l’intensité lumineuse à travers le cordon de raccordement à l’aide d’un capteur de lumière. Ajustez l’intensité du laser de sorte que le flux lumineux émis par le câble de raccordement soit de ~5-7 mW.
4. Placez les rats dans une cage de logement propre. Retirez les couvercles anti-poussière et les manchons de virole, exposant les viroles. Connectez les cordons de raccordement bilatéralement aux implants de fibre optique. Laissez les rats explorer l’environnement pendant 3 minutes avant l’induction de la LTD.
5. Allumez le générateur d’impulsions pour lancer la stimulation optogénétique.
   REMARQUE : Bien que cela soit peu probable, si les rats ressentent des réactions indésirables à la stimulation, l’expérience est immédiatement terminée et les rats sont correctement euthanasiés selon les directives de l’établissement.
6. Après l’induction de la LTD, gardez les rats dans la cage pendant 3 minutes, puis remettez-les dans leur cage domestique.
7. Pour les expériences de contrôle, utilisez la même procédure de stimulation sur des rats qui expriment le virus de contrôle AAV5-tdTomato. Pour les expériences fictives, attachez un cordon de raccordement à la fibre optique de rats qui expriment le virus AAV5-oChIEF, mais aucune stimulation n’est délivrée pendant une séance de 15 minutes.

4. Testez l’effet de la stimulation optogénétique sur la recherche de cocaïne induite par des indices

1. 24 h après les stimulations optogénétiques in vivo, remettez les rats dans des chambres de conditionnement opérantes. Les rats sont soumis à une séance standard de réintégration induite par un signal de 1 h pour évaluer le comportement de recherche de cocaïne.
   REMARQUE : Lors de la réintégration induite par un signal, une réponse sur le levier actif produit une présentation de 10 secondes du signal associé à la cocaïne, mais pas de perfusions de cocaïne.
2. Effectuer un deuxième test de réintégration au moins 1 semaine après le premier test pour déterminer si l’induction optogénétique de la DLT entraîne une suppression à long terme de la recherche de cocaïne

Matériaux