Imagerie des tissus profonds du cerveau d’un poisson-zèbre à l’aide d’un microscope à fluorescence à trois photons

Résumé

Source : Hontani, Y., et al. Microscopie à fluorescence à trois photons dans les tissus profonds dans le cerveau intact d’une souris et d’un poisson-zèbre. J. Vis. Exp. (2022)

Cette vidéo montre la configuration et l’exécution de l’imagerie à trois photons dans le cerveau d’un poisson-zèbre anesthésié. Le protocole permet la visualisation des tissus profonds de neurones marqués par fluorescence, révélant l’activité neuronale et les structures en temps réel pour les applications de recherche en neurosciences.

Protocole

Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.

1. Imagerie intravitale dans le cerveau du poisson-zèbre
   REMARQUE : Pour localiser correctement le cerveau du poisson sous l’objectif de l’objectif, une caméra CCD (dispositif à couplage de charge secondaire) est utilisée sur le même chemin que la lumière d’excitation pour l’imagerie à grand champ.
   
   1. Configurez le microscope et calibrez la puissance.
   2. Placez un objectif à faible grossissement (généralement 4x) sur le microscope.
   3. Placez la boîte de Pétri contenant le poisson et les tubes sous le microscope.
   4. Utilisez une source lumineuse à diode électroluminescente (LED) pour éclairer la boîte de Pétri.
   5. Ouvrez le mode Appareil photo du logiciel d’acquisition d’images (Figure 1).
   6. Cliquez sur En direct.
   7. Choisissez le canal A sur le côté droit de l’écran.
   8. Ajustez les paramètres de l’histogramme pour voir l’image clairement.
      REMARQUE : Ceux-ci doivent être mis à jour si nécessaire.
   9. Réglez le réglage du moteur sur le contrôleur de moteur sur Base.
   10. Abaissez l’objectif jusqu’à ce que le poisson soit visible.
       REMARQUE : Assurez-vous que la lentille de l’objectif n’entre pas en contact physique avec la tête.
   11. Placez le centre de la tête du poisson au centre du champ de vision.
   12. Déplacez l’objectif vers le haut et éloignez-le de la tête du poisson.
   13. Remplacez l’objectif à faible grossissement par l’objectif à grande ouverture numérique (AN) pour 3PM (microscopie à trois photons).
       REMARQUE : Il n’est pas nécessaire que l’objectif à faible grossissement et l’objectif à grande ouverture numérique (AN) soient parfocaux, mais doivent être suffisamment proches pour que le poisson se trouve dans le champ de vision de l’objectif à grande ouverture numérique.
   14. Abaissez lentement la lentille de l’objectif, en vous assurant que l’objectif n’entre pas en contact physique avec la tête. Dans le logiciel de la caméra CCD, arrêtez de déplacer l’objectif lorsque le haut de la tête est visible. Réglez l’emplacement z sur 0 μm.
       REMARQUE : Assurez-vous qu’il n’y a pas de bulles d’air sous la lentille de l’objectif lors de l’utilisation d’un objectif à immersion dans l’eau.
   15. Éteignez la source lumineuse LED et fermez le rideau sombre autour du système.
   16. Réglez le logiciel d’acquisition d’images en mode GG multiphotonique pour l’imagerie 3P et réglez la puissance sous l’objectif sur moins de 1 mW (avec un taux de répétition d’impulsions de ~1 MHz).
   17. Changez le bouton de réglage du moteur de Base à Objectif sur le contrôleur de moteur.
   18. Baissez les lumières de la pièce.
   19. Allumez les tubes photomultiplicateurs (PMT) et ouvrez l’obturateur de la source d’excitation 3PM. Assurez-vous qu’un contour de l’os apparaît dans le canal du signal de fluorescence dû à l’autofluorescence et dans le canal du signal de génération de troisième harmonique (THG) dû au THG de l’os (Figure 1C).
   20. Effectuez des images à différentes profondeurs en augmentant les niveaux de puissance lors de l’imagerie plus profonde.

Résultats

Figure 1 : Captures d’écran représentatives pour l’imagerie intravitale chez les poissons (protocole section 1).) Vue du mode caméra du logiciel d’acquisition d’images avec objectif 4x en place. Les principales car...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
5 % Povidone-iode	Amazon	NDC 67818-155-32	Nettoyage aceptif des zones chirurgicales
70 % Ethanol	Thermo Fisher Scientific	CAS 64-17-5	Nettoyage aceptical des zones chirurgicales
Agarose	Sigma	A4718-256	Préparation de la chambre du poisson-zèbre
Bergame II	Thorlabs		Microscope d’imagerie multiphotonique
Bupivacaïne	Cornell Veterinary Care
GaAsP Détecteur PMT amplifié	Thorlabs	PMT2100
Chauffage (800 W)	Finnex		Chauffage d’aquarium pour l’eau du poisson zèbre)
Kimwipes	Kimtech		Tissu de laboratoire pour la préparation du poisson-zèbre
Seringue Nanofil (10 micromètres) avec aiguille 36 G	WPI	NANOFIL + NF36BV	Seringue et aiguille pour l’injection de bromure de pancuronium
Pompe péristaltique Elemental	Science	ESI MP2	Pompe à eau pour installation poisson-zèbre
Tube en polyéthylène (D.I. 0,58 mm., D.E. 0.965 mm.)	Tube de	pompe Elemental Science MP2	Tube qui va dans la bouche du poisson-zèbre
SR400	Stanford Research Systems	SR400	Compteur
de photons Capteur de puissance à photodiode standard	Thorlabs	S122C	Détecteur de puissance
Cire de boxe à bande mince	Corning Rubber Co., Inc.		Tubulure de maintien en place dans la chambre du poisson-zèbre
ThorImage Thorlabs	Logiciel d’acquisition d’images
Tricaïne (sel de méthanesulfonate d’éthyl-m-aminobenzoate)	MP	103106	Anesthésie et euthanasie du poisson-zèbre
Tubulure Tygon (D.I. 1/16 po, D.E. 1/8 po)	Tygon		Tube pour l’écoulement de l’eau pour la préparation du poisson zèbre
VaporGuard	VetEquip	931401	Pour le recyclage de l’isoflurane
Adhésif pour tissu Vetbond 3M		1469SB	Pour coller la fenêtre en verre sur le crâne de la souris et pour coller le tissu de laboratoire lors de la préparation du poisson.
XLPLN25XWMP2	Objectif dédié à l’excitation multiphotonique	d’Olympus