Imagerie de la migration des cellules tumorales dans le tissu du glioblastome à l’aide de la microscopie confocale à balayage time-lapse

Résumé

Source : Parker, J. J., et al. Un modèle de culture de coupe organotypique de glioblastome humain pour l’étude de la migration des cellules tumorales et des effets spécifiques au patient des médicaments anti-invasifs. J. Vis. Exp. (2017)

Cette vidéo présente l’imagerie de coupes de tissu de glioblastome exprimant la protéine fluorescente verte (GFP) par microscopie confocale. Des images haute résolution sont capturées à intervalles réguliers pour suivre le mouvement et la direction des cellules tumorales.

Protocole

Toutes les procédures impliquant le prélèvement d’échantillons ont été effectuées conformément aux directives de l’IRB de l’institut.

1. Marquage des cellules tumorales via une protéine fluorescente verte exprimant le rétrovirus

REMARQUE : La microscopie à intervalle de temps pour l’analyse de la migration des cellules tumorales nécessite un marquage fluorescent stable et à long terme des cellules au sein de la culture de tranches. L’utilisation du rétrovirus est suggérée parce qu’il infecte sélectivement les cellules en division, enrichissant ainsi le marquage fluorescent au sein de la population de cellules tumorales par opposition à la microglie ou à d’autres types de cellules présents dans la tranche. La standardisation de l’infection suggère qu’un titre viral de 10⁴ UFC/μL entraîne une expression suffisante de la protéine fluorescente verte pour le suivi et l’analyse de la migration cellulaire. L’augmentation du titre viral, l’utilisation de virus non sélectifs (c’est-à-dire l’adénovirus, le lentivirus) ou d’autres moyens de marquage de toutes les cellules peuvent empêcher l’identification de limites cellulaires claires pendant la migration, compliquant ainsi l’analyse. L’utilisation de marqueurs fluorescents alternatifs peut être utilisée et optimisée au besoin.

1. Obtenir le rétrovirus pour l’infection des tranches tumorales soit via des protocoles standard5,14, soit à partir d’une source disponible dans le commerce. Diluer le surnageant viral en ajoutant le volume approprié dans un milieu neuronal non supplémenté pour obtenir un titre viral de 10⁴ UFC (unités formant colonies) /μL.
2. Entre 7 et 10 jours de culture, infectez les cultures de coupe tumorale d’intérêt avec 5 à 10 μL de virus (10 4 UFC/μL). Placez le virus doucement goutte à goutte sur la surface de chaque tranche de tissu. Diminuez le volume surnageant ajouté si la tranche flotte à la surface de l’insert. Remettre les plaques contenant les cultures en tranches dans un incubateur.
3. Évaluez les coupes pour les cellules tumorales marquées à partir de 24 heures après l’infection virale. Ce délai variera en fonction de l’incorporation virale et de la cinétique d’expression des gènes de fluorescence. Pour les constructions virales utilisées ici, il a fallu 72 h pour observer un signal fluorescent robuste avec un microscope à épifluorescence standard.
   REMARQUE : Rarement, les coupes présentent une distribution principalement périphérique de cellules marquées viralement, ce qui peut compliquer l’imagerie confocale. Pour éviter cette complication, essayez de réduire l’épaisseur de la tranche et les variations d’épaisseur sur la tranche. Si la culture de la tranche a une région plus épaisse près du centre, cela peut empêcher une pénétration adéquate des nutriments, limitant ainsi la population de cellules tumorales en division active. Un essai qualitatif pour dépister cette complication consiste à ajouter un réactif de colorant de tétrazolium (c.-à-d. MTT (bromure de 3-(4,5-diméthylthiazol-2-yl)-2,5-diphényltétrazolium)) au milieu de culture en tranches. Les zones de la tranche qui ne deviennent pas bleues après l’ajout du réactif indiquent un manque d’activité métabolique et une santé compromise de la tranche.

2. Imagerie confocale à balayage laser à photon unique en accéléré de la migration des cellules tumorales

REMARQUE : Une fois la transduction réussie et la santé de la culture confirmée, les cellules peuvent être imagées dans des conditions de contrôle, suivies d’une période égale d’imagerie dans des conditions de traitement. À l’aide de ce protocole, les cellules ont été imagées et suivies avec succès pendant 12 heures dans chaque condition. Cependant, des périodes plus ou moins longues d’imagerie et de manipulation de l’environnement peuvent également être informatives.

1. Chargement du Microscope
   1. Avant l’imagerie, placez 1 ml de milieu frais dans un plat à fond de verre.
   2. Laisser le milieu dans la boîte à fond de verre s’équilibrer dans un incubateur pendant 15 min.
      REMARQUE : À ce stade, des agents de marquage solubles, tels que des lectines conjuguées par fluorescence (c’est-à-dire l’isolectine IB4 pour le marquage de la microglie) ou des points quantiques conjugués à ligand, peuvent être ajoutés au milieu de culture en tranches pour l’identification des sous-populations cellulaires pendant l’imagerie.
   3. Transférez l’insert à imager dans une parabole à fond de verre à l’aide d’une pince stérile dans une hotte à flux laminaire. Transportez la boîte jusqu’à la platine du microscope.
   4. Maintenez les cultures en tranches à 37 °C et à 5 % d’atmosphère de CO₂ dans un incubateur de microscope scellé. Utiliser une humidification stérile en H₂O de la chambre d’incubation si possible pour éviter une évaporation excessive du milieu (particulièrement important pour les expériences d’imagerie plus longues).
   5. Utilisez un microscope confocal avec une longue distance de travail, un objectif aérien 10X et une excitation laser pour les photons uniques et/ou multiphotons. note: Assurez-vous que l’objectif du microscope offre une distance de travail adéquate. En raison de la hauteur supplémentaire de l’incubateur de scène, de la parabole à fond en verre et de l’insert de culture tissulaire, les objectifs de longue distance de travail sont essentiels.
   6. Fixez la plaque inférieure en verre, retirez le couvercle en plastique de la boîte de Pétri et recouvrez d’une membrane perméable aux gaz.
2. Image Acquisition
   1. Utilisez le microscope pour inspecter visuellement la coupe et localiser un champ approprié avec une densité adéquate de cellules tumorales marquées par fluorescence entre le bord de la tranche et le centre. Évitez les champs d’imagerie sur le bord de la coupe, en raison de la susceptibilité accrue aux déplacements tissulaires pendant l’imagerie. Des harpes à tranches de tissu peuvent être utilisées pour limiter ce décalage.
   2. Utilisez un logiciel d’imagerie en mode d’analyse multidimensionnelle pour définir les limites de la première (en bas) et de la dernière (en haut) de la pile Z, de sorte que toutes les positions à imager contiennent un signal cellulaire fluorescent visible. L’imagerie sur 150 à 200 μm de la tranche, avec un pas Z constant de 10 μm, a fourni une résolution adéquate pour le suivi des trajets cellulaires (elle peut être ajustée pour les besoins d’imagerie individuels).
   3. Si le microscope est équipé d’une platine motorisée, assurez-vous de disposer de suffisamment de temps pour chaque acquisition de la pile Z. Réglez l’intervalle de temps entre les acquisitions pour qu’il soit égal au temps de balayage par position x nombre de positions à imager (c’est-à-dire les régions tumorales imagées).
      REMARQUE : Pour l’excitation simultanée des fluorophores vert et rouge, utilisez un programme de balayage linéaire laser à deux lignes, avec une excitation simultanée de 488 nm et 633 nm. La longueur d’onde de l’excitation laser sélectionnée variera en fonction des protéines fluorescentes individuelles exprimées.
   4. Maintenez une puissance laser uniforme et des paramètres de sténopé confocal entre les régions tumorales imagées. Utilisez le réglage de puissance laser le plus bas nécessaire pour délimiter clairement les corps et les processus cellulaires tumoraux afin de limiter la phototoxicité. Les unités de paramètres d’imagerie spécifiques (c’est-à-dire la puissance et les paramètres de sténopé confocal) varient en fonction des spécifications du microscope et de la source laser.
   5. Compensez l’évaporation potentielle du support en ajoutant 2 à 3 pas de pile Z « tampon » dans les plans focaux avançant vers l’objectif. Cela empêche efficacement le tissu de quitter la plage d’acquisitions de la pile Z dans le plan vertical.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
DMEM High Glucose	Invitrogen (Gibco)	11960-044
Neurobasal-A Medium, moins le rouge de phénol	Invitrogen (Gibco)	12349-015
B-27 Supplement (50X), Invitrogen sans sérum	(Gibco)	17504-044
Pénicilline-Streptomycine (10 000 U/mL)	Invitrogen (Gibco)	15140-122
Supplément GlutaMAX	Invitrogen (Gibco)	35050-061
L-Glutamine (200 mM)	Invitrogen (Gibco)	25030-081
HEPES (1 M)	Invitrogen (Gibco)	15630-080
Nystatine Suspension	Sigma-Aldrich	N1638-20ML	10 000 unités/mL dans DPBS, traité aseptiquement, BioReagent, adapté à la culture cellulaire
UltraPure Low Melting Point Agarose	Invitrogen (Gibco)	16520-050	Fond à 65,5 °C, reste fluide à 37 °C et durcit rapidement en dessous de 25 °C.
Isolectine GS-IB4 de Griffonia simplicifolia, Alexa Fluor 647 Conjugué	Thermo Fisher (Sondes moléculaires)	I32450	Utilisé dans les milieux pour l’étiquetage des microglies/macrophages
pRetroX-IRES-ZsGreen1 Vecteur	Clonetech	632520
Concentrateur Retro-X	Clonetech	31455	Résine de liaison pour la concentration non ultracentrifuge des surnageants viraux
vecteur pVSG-G	Clonetech	631530	fait partie du système d’expression rétrovirale universel Retro-X
GP2-293 Cellules d’emballage viral	Clonetech	631530	fait partie du système d’expression rétrovirale universel Retro-X
Colle cyanoacrylate (Super Glue)	Sigma-Aldrich	Z105899	viscosité moyenne
(carré - S22)	Polysciences, Inc.	18646A-1	Moules pour l’enrobage d’échantillons tumoraux
Micro-spatules en acier inoxydable	Fisher Scientific	S50823	Pliez l’instrument à 45 degrés au niveau du col de la lame de la cuillère
Pince de dissection à pointe fine incurvée Fisher	Scientific	08-875
Lame de rasoir à un seul tranchant (rasoirs de sécurité américains)	Fisher Scientific	17-989-001	Le bord de la lame a une épaisseur de 0,009 po. Le couvercle à bord émoussé serti est retiré avant le chargement sur le vibratome.
Leica VT1000 S Vibratome	Leica Biosystems	VT1000 S
Insert de culture cellulaire en PTFE hydrophile	EMD Millipore	PICM0RG50	30 mm, PTFE hydrophile, taille des pores de 0,4 μm 35
mm Plats à fond en verre	MatTek	P35G-1.5-20-C Manchon	verre de 20 mm de diamètre. Epaisseur du verre 1,5
LSM 510 Micoscope confocal	Zeiss	LSM 510	10x Objectif à air (c-Apochromat NA 0,45)
Incubateur PECON Stagetop	PeCON Allemagne	(Discontinué)	L’incubateur PM 2000 RBT est un produit compatible conçu pour être utilisé avec les microscopes Zeiss.

Moule d’enrobage Peel-A-Way de en