Imagerie calcique spontanée pour la dynamique spécifique des compartiments dans les astrocytes

Dans cet article

Résumé

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Source : Bannai, H., et. al., Dissection of Local Ca2+ Signals in Cultured Cells by Membrane-targeted Ca2+ Indicators. J. Vis. Exp. (2019)

La vidéo fait la démonstration de l’imagerie par fluorescence pour observer la dynamique calcique spontanée spécifique du compartiment dans les astrocytes en surveillant séquentiellement les protéines sensibles au calcium localisées sur la membrane plasmique et le réticulum endoplasmique.

Protocole

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1. Imagerie Ca²⁺

Enregistrement des activités spontanées des astrocytes exprimant Lck-RCaMP2 et OER-GCaMP6f/
REMARQUE : Sans optique de division d’image, les signaux Ca²⁺ au niveau de la membrane plasmique et ceux autour du réticulum endoplasmique (RE) peuvent être surveillés dans la même cellule. Ici, l’enregistrement séquentiel de Lck-RCaMP2 (indicateur de Ca²⁺ génétiquement codé ciblant la membrane plasmique) et OER-GCaMP6f (indicateur de Ca²⁺ génétiquement codé ciblant la membrane du réticulum endoplasmique externe) dans les mêmes astrocytes est décrit. Un objectif à immersion dans l’huile avec une ouverture numérique supérieure à 1,3 est fortement recommandé pour l’activité spontanée de Ca²⁺.
1. Allumez le microscope, la caméra, la source lumineuse et la chambre de chauffage du microscope pendant au moins 30 min avant d’enregistrer.
2. Montez la lamelle contenant les cellules transfectées avec Lck-RCaMP2 et OER-GCaMP6f dans la chambre d’enregistrement et ajoutez 400 μL de support d’imagerie. Placez un couvercle sur le dessus de la chambre.
3. Choisissez le jeu de filtres pour GCaMP6f et la source lumineuse (lumière d’excitation bleue, par exemple 470– 490 nm ; voir le tableau des matériaux). Localisez les astrocytes exprimant OER-GCaMP6f.
4. Choisissez un jeu de filtres et la source lumineuse pour RCaMP2 (lumière d’excitation verte, par exemple 510–560 nm ; voir le tableau des matériaux) et vérifiez si Lck-RCaMP2 est exprimé dans les mêmes astrocytes. Évitez une longue exposition à la source lumineuse pour éviter le photoblanchiment.
5. Enregistrez des images en accéléré du Lck-RCaMP2 à 2 Hz pendant 2 min. Enregistrez les données d’imagerie sur le disque dur.
6. Remplacez le filtre défini sur celui de GCaMP6f. Enregistrez des images en accéléré de l’OER-GCaMP6f dans le même champ de vision à 2 Hz pendant 2 min. Enregistrez les données sur le disque dur.
7. Analysez les données à l’aide du logiciel d’analyse d’images.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Couvercle circulaire de 18 mm de diamètre	Karl Hecht « Assistent"	#41001118	Épaisseur 1, lamelles circulaires de 18 mm de diamètre ; des lamelles alternatives peuvent être utilisées.
Caméra pour l’enregistrement d’images			Les caméras suivantes étaient disponibles : caméra CCD refroidie (par exemple, Hamamatsu Photonics, OECA-ER), caméra EM-CCD (par exemple, Hamamatsu Photonics, ImagEM ; Andor, iXon) ou une caméra CMOS (par exemple, Hamamatsu Photonics ORCA-Flash4.0)
		d’analyse d’images	tel que Metamorph (Molecular Devices), Image J (NIH) et TI Workbench14 (sur mesure)
Support d’imagerie et tampon			le support ou le tampon optimal pour l’expérience. Lorsqu’un milieu est utilisé, un milieu sans rouge de phénol est souhaitable pour réduire la fluorescence de fond. Ajouter 20 mM d’HEPES pour maintenir le pH à l’extérieur de l’incubateur de dioxyde de carbone.
		à fluorescence inversée	tel que IX73 (Olympus) ou Eclipse TI (Nikon Instech)
Jeu de filtres de microscope pour l’imagerie			Filtre approprié pour GFP (excitation, 480 ± 10 nm ; émission, 530 ± 20 nm)
Jeu de filtres de microscope pour l’imagerie			Filtre approprié pour RFP (excitation, 535 ± 50 nm ; émission, passage long 590 nm)
Système			du microscope Système de chauffage permettant de maintenir les cellules à 37 °C pendant l’imagerie. Pour éviter la dérive causée par la dilatation thermique, il est recommandé d’utiliser des systèmes de chauffage couvrant l’ensemble du microscope lui-même (par exemple, Tokai Hit, Thermobox).
Source lumineuse de microscope pour l’excitation			Lampe à mercure (100 W), lampe au xénon (75 W), système d’éclairage à diodes électroluminescentes (LED) (par ex. CoolLED Ltd., precisExcite ; Thorlabs Inc., source LED à 4 longueurs d’onde ; Lumencor, moteur de lumière SPECTRA X). En cas de masse de mercure et de lampe au xénon, utilisez un filtre ND pour réduire l’intensité de l’excitation.
L’objectif			immersion dans l’huile Plan-Apochromat avec une ouverture numérique supérieure à 1,3 est fortement recommandé pour l’enregistrement de l’activité spontanée du Ca²⁺ dans les neurones et les astrocytes.
Chambre d’enregistrement	Elveflow	Ludin	Cette chambre d’enregistrement est destinée aux lamelles rondes de 18 mm de diamètre.
Stéréomicroscope			Utilisé pour disséquer l’hippocampe. Des stéréomicroscopes Olympus SZ60 ou équivalents sont disponibles.

microscopiques Logiciel Utilisez Microscope GCaMP6f RCaMP2 de chauffage à

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