Induction d’une lésion du nerf fibulaire chez une souris pour étudier la régénération de la jonction neuromusculaire

Résumé

Source : Dalkin, W., et al. La méthode des lésions du nerf fibulaire : un test fiable pour identifier et tester les facteurs qui réparent les jonctions neuromusculaires. J. Vis. Exp. (2016)

Cette vidéo montre une intervention chirurgicale visant à induire une lésion du nerf fibulaire chez une souris afin d’étudier la régénération de la jonction neuromusculaire (JNM). La procédure consiste à exposer le nerf fibulaire, à appliquer une pression contrôlée pour induire une lésion et à s’assurer que l’épineurium reste intact pour favoriser la régénération axonale. Au fil du temps, les macrophages éliminent les débris axonaux, facilitant la réparation nerveuse et le rétablissement des JNM.

Protocole

Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.

1. Préparation des animaux à la chirurgie

1. Anesthésie des souris avec un mélange de kétamine (90 mg/kg) et de xylazine (10 mg/kg) par injection inguinale sous-cutanée avec une seringue d’insuline stérile de 1 ml. La solution porteuse contient un mélange de solution saline à 0,9 %, de 17,4 mg/ml de kétamine et de 2,6 mg/ml de xylazine. Remettez les animaux dans des cages en attendant que le médicament fasse effet.
   REMARQUE : Si la dose de charge ne fournit pas suffisamment d’anesthésie pour la durée de l’intervention, 25 % supplémentaires de la dose de charge peuvent être injectés.
2. Surveiller les animaux après l’injection pour vérifier si la fréquence respiratoire est stable et si les niveaux d’excitation sont déprimés. Vérifiez le niveau d’excitation à l’aide d’une pince du pied arrière, qui ne devrait susciter aucune réponse lorsqu’elle est suffisamment anesthésiée.
   REMARQUE : Cela prend généralement 3 à 5 minutes pour une jeune souris adulte pesant en moyenne 25 à 30 g. Si l’animal réagit toujours 10 minutes après l’injection, 25 % supplémentaires de la dose de charge anesthésique peuvent être injectés.
3. Appliquez de la vaseline et de la pommade ophtalmique légère à l’huile minérale sur les yeux de l’animal pour prévenir le dessèchement. Retirez les animaux de la cage et placez-les sur une surface propre et plane. Rasez le membre postérieur souhaité du pied au bassin à l’aide d’une tondeuse à cheveux électrique, en exposant uniquement l’aspect latéral du membre.
4. Appliquez un épilateur chimique sur le site rasé pendant 1 min. Retirez manuellement les poils à l’aide de lingettes de laboratoire. Nettoyez la zone épilée avec une lingette de laboratoire imbibée d’éthanol.

2. Procédure chirurgicale

1. Stérilisez les instruments chirurgicaux via un autoclave ou une autre méthode appropriée. Nettoyez le site chirurgical et la planche chirurgicale avec 80 % d’éthanol / H₂O. Désinfectez le site chirurgical avec de la providone. Placez la souris sur la planche chirurgicale et alignez-la avec les attaches des membres. Gardez le membre postérieur cible dans une position anatomiquement naturelle avec l’articulation du genou légèrement étendue sans rotation interne ou externe.
2. Placez l’animal et la planche sous le microscope chirurgical. Orientez-vous vers le site d’incision approprié par palpation des points de repère superficiels, en particulier l’articulation osseuse du genou et la crête entre les muscles tibiaux antérieurs et gastrocnémiens.
3. Faites une incision d’environ 3 cm à travers la peau à l’aide d’un scalpel ou de ciseaux à ressort tout en utilisant une pince générale pour la préhension. Faites l’incision perpendiculairement au trajet sous-jacent du nerf fibulaire commun.
4. Poursuivez l’incision à travers le fascia superficiel, en exposant les muscles biceps fémoral et vaste latéral. Séparez ces muscles en coupant à travers le fascia profond qui les relie. Une coupe de 1 à 2 cm devrait suffire.
5. Rétracter le muscle biceps fémoral caudalement à l’aide d’écarteurs mécaniques, révélant le nerf fibulaire commun.
6. Tracez le nerf vers la partie proximale jusqu’à ce qu’il se rapproche du tendon de la tête latérale du muscle gastrocnémien.
   Remarque : L’exposition peut nécessiter une manipulation supplémentaire de la peau et du muscle rétractés. Cette intersection est utilisée comme un point de repère stable pour les lésions nerveuses.
7. Saisissez le nerf à l’aide d’une pince fine, en alignant les pointes de manière parallèle au bord latéral du tendon gastrocnémien. Écrasez le nerf fibulaire commun en appliquant une pression constante et forte pendant 5 secondes.
8. Corroborer l’écrasement complet du nerf par une inspection visuelle à travers la portée chirurgicale. Il apparaîtra translucide au site de la blessure. Si vous utilisez des souris exprimant des protéines de fluorescence dans les axones périphériques, la fluorescence disparaîtra du site de la lésion.
9. Retirez les écarteurs et réalignez les muscles dans leurs positions anatomiques. Fermez le site d’incision avec des sutures en soie 6-0. 1 à 3 sutures simples interrompues suffisent. Placez la souris en récupération sur un coussin chauffant dans une cage propre.
10. Surveillez tous les animaux pendant 2 heures après l’opération pour vérifier s’ils ne sont pas respiratoires et s’ils ne réagissent pas à l’anesthésie. Administrer une dose initiale de buprénorphine de 0,05 à 0,10 mg/kg par injection inguinale sous-cutanée immédiatement après la récupération de la chirurgie. Administrez 3 doses supplémentaires toutes les 12 heures au cours des 48 prochaines heures. Une fois complètement rétablies, retournez les souris à l’établissement de soins pour animaux.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Ketamine	VetOne	501072
Xylazine	Lloyd Inc.	3437
Buprénorphine	Zoopharm	1Z-73000-150910
Nair	Nair
Kim-wipes Kimtech		34155
Rasoir électrique	Braintree Scientific	CLP-64800
80 % EtOH/H₂O
10 % Proviodine
1 ml Seringue
insuline Ciseaux à ressort	Vannas	91500-09
N° 15 scalpel	Braintree Scientific	SSS 15
#5 Forceps	Dumont	11252-00
6-0 suture en soie sur aiguille coupante inversée	Suture Express	752B
Coussin chauffant pour rongeurs	Braintree Scientific	AP-R-18.5
Alexa 555 Sondes moléculaires alpha-BTX conjuguées		B35451
Vectashield	Vector Labs	H-1000
Microscope stéréo zoom Olympus		Olympus 562037192
Microscope confocal Zeiss 700 Zeiss
Pompe de perfusion péristaltique à débit variable	Fisher Scientific	13-876-3

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