Dans les organismes modèles, la transgénèse permet de manipuler les fonctions des gènes tandis ARNi peut knockdown transcrits d'ARNm spécifiques 1-2. Ce protocole vise à illustrer les techniques nécessaires pour introduire de l'ADN transmis de façon stable et transitoire ARN double brin dans le nématode necromenic Pristionchus pacificus Pour des études en biologie évolutive, de développement et de comportement.
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Article de méthode
ARNi Mediated inactivation génique et la transgénèse par microinjection dans le nématode Necromenic Pristionchus pacificus
Dans cet article
Résumé
Résumé
Bien qu'il soit plus abordable pour les organismes modèles émergents d'obtenir les génomes entièrement séquencés, encore en profondeur la fonction des gènes et des analyses d'expression par interférence ARN et de transgénèse stables restent limitées dans de nombreuses espèces en raison de l'anatomie particulière et moléculaire biologie cellulaire de l'organisme. Par exemple, en dehors de la couronne de Caenorhabditis groupe qui comprend trois Caenorhabditis elegans, de façon stable transmis lignées transgéniques chez les non-Caenorhabditis espèces n'ont pas été signalés dans ce phylum spécieuse (Nematoda), à l'exception de Strongyloides stercoralis 4 et 5 Pristionchus pacificus. Pour faciliter l'expansion du rôle de P. pacificus dans l'étude du développement, l'évolution et le comportement 6-7, nous décrivons ici les méthodes actuelles d'utiliser la micro-injection pour rendre les animaux transgéniques et inactivation de gènes par RNAi. Comme les gonades des P. pacificus est syncytial et capable d'incorporer de l'ADN et l'ARN dans les ovocytes sont envoyés par micro-injection directe. Contrairement à C. elegans Cependant, l'héritage transgène stable et expression somatique dans P. pacificus nécessite l'ajout d'ADN génomique digéré par les endonucléases auto complémentaire à l'extrémité des transgènes cibles et des marqueurs co-injection 5. L'ajout de l'ADN génomique porteuse est similaire à l'exigence de l'expression du transgène dans le Strongyloides stercoralis 4 et dans les cellules germinales de C. elegans. Toutefois, il n'est pas clair si l'exigence spécifique de l'ADN des animaux génomiques propres parce que P. pacificus soma est très efficace à réduire au silence non complexes multi-copie des gènes ou que les tableaux extrachromosomique dans P. pacificus nécessitent séquences génomiques pour l'assemblage kinétochore correcte lors de la mitose. La migration ventrale de l'(deux arméesdidelphic) gonades hermaphrodites complique encore plus la capacité d'injecter deux gonades dans les vers individuels 8. Nous démontrons également l'utilisation de micro-injection d'un mutant dominant knockdown (rouleau, tu92) en injectant l'ARN double brin (ARNdb) dans les gonades d'obtenir non roulants F 1 progéniture. Contrairement à C. elegans, mais comme la plupart des autres nématodes, P. pacificus PS312 n'est pas réceptif à l'ARNi systémique via l'alimentation et le trempage et donc ARNdb doivent être administrés par microinjection dans les gonades syncytial. Dans cette étude, nous espérons pour décrire le processus de microinjection nécessaires pour transformer un promoteur PPA-EGL-4:: Un journaliste de fusion GFP et démontable d'un rouleau dominante PRL-1 (tu92) mutant dans un protocole visuel informatif.
Protocole
1. La transgénèse: préparation de l'ADN
- Dominantes de co-injection de marqueur: pRL3 [PPA-PRL-1 (tu92)]
Le plasmide pRL3 est une dominante de co-injection de marqueur pour identifier visuellement des événements de transformation réussie. Ce plasmide codant pour un allèle dominant mutant (tu92) du gène de la PPA-PRL-1 étroitement lié à la SQT-1 du gène du collagène en C. elegans et transforme le mode de locomotion de type sauvage dans le sens horaire sinusoïdale mouvements de torsion le long du corps du ver axe 1,5. L'animal transformé est très similaire au marqueur de sélection dominant ....
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Discussion
Populations de P. pacificus sont trouvés en association étroite avec diverses espèces de scarabées dans le monde et est un nématode modèle intermédiaire entre vivre libre et les nématodes parasitaires. La force du P. pacificus comme un organisme modèle émergent réside dans l'intégration de ses cartes génétiques et physiques qui favorisent la cartographie de positionnement des mutants isolés de impartiale écrans avant génétique (c'est à dire pas seulement pour les gènes candidats précéd.......
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Déclarations de divulgation
Pas de conflits d'intérêt déclarés.
Remerciements
Les auteurs sont très reconnaissants à RJ Sommer et X Wang pour l'aide aux micro-injection, ainsi que des commentaires perspicaces de la évaluateurs anonymes. Ce travail est soutenu par le NIH octroi SC2GM089602.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Produit: | Catalogue #: | Fournisseur: | |
| DMI3000 microscope à injection | DMI3000 | Leica | |
| Manipulateur microinjecteur (entraînement direct) | Conjointe Narashige BC-Ball 3 | Tritech recherche | |
| Extracteur d'aiguilles | Narashige PC-10 | Tritech recherche | |
| Microinjecteur ™ All-numérique multi-pression du système | Narashige MINj-D | Tritech recherche | |
| GeneElute ™ ADN génomique des mammifères Miniprep Kit | G1N70 | Sigma | |
| pJet Clonage Jet Kit | K1231 | Fermentas | |
| GeneJET plasmide Miniprep kit | K0502 | Fermentas | |
| DNA Clean & concentrateur ™ | D4005 | Zymo recherche | |
| BLOC-IT ™ ARNi TOPO ® kit de transcription | K3500-01-0 & K36501 | Invitrogen | |
| Difco ™ Agar Noble | DF0142-15-2 | Fisher Scientifi | |
| Couvercle en verre de microscope (1,5 - 0,19 mm d'épaisseur 0,16 à; Taille: 50 x 45mm) | 12 à 554-F | Fisher Scientific | |
| Capillaires en verre (filament) | 615000 | Systèmes AM | |
| Huile de paraffine (Lourd) | O122-1 | Fisher Scientific | |
| KH 2 PO 4 | P386-500 | Fisher Scientific | |
| Na 2 HPO 4 | AC20651-5000 | Fisher Scientific | |
| NaCl | BP3581 | Fisher Scientific | |
| MgSO 4 | M80-500 | Fisher Scientific |
Références
- Fire, A., Xu, S., Montgomery, M. K., Kostas, S. A., Driver, S. E., Mello, C. C. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391, 806-811 (1998).
- Ahringer, J. Reverse Genetics. Wormbook. , (2006).
- Mello, C. C., Kramer, J. M., Stinchcomb, D., Ambros, V.
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Réimpressions et autorisations
