Suivi des rampants neutrophiles intraluminale, migration trans et le chimiotactisme dans les tissus par microscopie intravitale Vidéo

Résumé

Nous décrivons un protocole de fond clair microscopie intravitale pour la mesure dynamique des interactions cellulaires des neutrophiles-endothélium lors du recrutement des neutrophiles en réponse à la source d'un facteur chimiotactique des neutrophiles in vivo. Neutrophiles ramper intraluminale, migration trans et le chimiotactisme dans les tissus de souris crémaster sont visualisés avec la photographie vidéo en temps-caduque et suivis avec ImageJ.

Résumé

Le recrutement des leucocytes circulants à partir du flux sanguin vers les tissus enflammés est un processus crucial et complexe de ^1,2 inflammation. Dans le veinules post des tissus enflammés, les leucocytes d'abord d'attache et rouler sur la surface luminale de veinules mur. Rouler arrestation leucocytes sur l'endothélium et subissent adhésion ferme en réponse à chimiokine ou chimiotactiques autre sur la surface des veinules. Beaucoup de leucocytes adhérents relocaliser sur le site initial de l'adhésion au site d'extravasation jonctionnelle dans l'endothélium, un processus appelé intraluminale ramper ^3. Suite à ramper, se déplacer à travers l'endothélium des leucocytes (transmigration) et migrent dans les tissus extravasculaires vers la source de chimiotactique (chimiotactisme) ^4. Microscopie intravitale est un outil puissant pour la visualisation des interactions leucocytes-endothélium in vivo et révèle les mécanismes cellulaires et moléculaires du recrutement des leucocytes ^2,5. Dans ce rapport, nous fournissons une description détaillée de l'utilisation de la microscopie intravitale fond clair de visualiser et de déterminer le processus détaillé de recrutement des neutrophiles chez la souris crémaster muscle en réponse à la pente d'un facteur chimiotactique des neutrophiles. Pour induire le recrutement de neutrophiles, un petit morceau de gel d'agarose (~ 1 mm ³ dimensions) contenant chimiotactique des neutrophiles MIP-2 (CXCL2, une chimiokine CXC) ou WKYMVm (Trp-Lys-Tyr-Val-D-Met, un analogue synthétique des peptides bactériens) est placé sur le tissu musculaire adjacent à la veinule observés postcapillaires. Avec le temps écoulé, la photographie vidéo et l'ordinateur le logiciel ImageJ, neutrophiles ramper intraluminale sur l'endothélium, la migration des neutrophiles transendothéliale et de la migration et le chimiotactisme dans les tissus sont visualisés et suivis. Ce protocole permet une analyse fiable et quantitative de nombreux paramètres tels que le recrutement de neutrophiles vitesse de ramper intraluminale, le temps de la transmigration, le temps de détachement, la vitesse de migration, la vitesse et l'indice de chimiotactisme chimiotactisme dans les tissus. Nous démontrons que l'utilisation de ce protocole, ces paramètres peuvent être le recrutement de neutrophiles stable déterminée et la locomotion cellule unique commodément suivi in vivo.

Protocole

1. Préparation de Chemoattractant en gel d'agarose

1. Pipeter 10 mL de 2 × PBS dans un tube conique de 50 ml, et de se réchauffer le tube en le plaçant dans un bécher contenant de l'eau chaude.
2. Pipeter 10 mL d'eau distillée et ajouter 0,4 g de poudre d'agarose dans un autre tube conique de 50 ml (avec son bouchon légèrement desserré) et chauffer le mélange jusqu'à ce que d'ébullition dans un four à micro-ondes (pour ~ 1 min dans un four à micro-ondes de 700 watts) .
3. Ajouter le réchauffé 2 × PBS à la solution d'agarose du tube, agiter la solution mixte et garder au chaud dans le bécher d'eau chaude.
4. Solution chimioattractive Micro....

Discussion

Microscopie intravitale est l'outil indispensable pour révéler les mécanismes cellulaires et moléculaires de recrutement des leucocytes pendant l'inflammation. La visualisation quantitative pour la détermination des interactions leucocytes-endothélium dans les microvaisseaux des tissus translucides tels que le muscle crémaster et le mésentère reste le gold standard pour l'application de la technique de ^1,5. La microscopie à fond clair conventionnels intravitale a beaucoup uniques caractéristiques .......

Matériaux

Tableau: Matériaux, réactifs et équipements spécifiques

Nom du réactif / équipements	Société	Numéro de catalogue	Commentaires
Des tuyaux en polyéthylène, PE10	Becton Dickinson	427401	ID 0.28mm x 0,61 mm OD
Encre de Chine	Speedball Art	Super Black	Pigments de carbone sans colorants 100% noir
Cautère	Aaron médicale	AA03
Xylazine	Bayer HealthCare, Bayer Inc	DIN 02169592
Le chlorhydrate de kétamine	Bioniche Animal Health Canada Inc	DIN 01989529
Murin MIP-2 recombinante	R & D Systems	452-M2
WKYMVm	Phoenix Pharma, Inc	072-12
Agarose	Invitrogen	15510-027	Ultrapure
Héparine	Sigma	H-3393
Microscope droit	Olympus	BX61WI
3CCD caméra vidéo couleur	SONY	DXC-990
HD-DVD enregistreur vidéo	LG Electronics Inc	RH398H-M
Moniteur TV	LG Electronics Inc	22LG30
Circulateur d'eau	Thermo Scientific	DC10 HAAKE
Pompe péristaltique	Gilson; Pharmacia	Gilson Minipuls 3; Pharmacia P-3
Conseil crémaster	Université de la Saskatchewan		Home-made