Un modèle de contusion unilatérale des blessures moelle épinière cervicale aide de l'impacteur Infinite Horizon

Résumé

Une façon fiable et reproductible pour produire un col de l'utérus blessures unilatérale moelle épinière aide de l'impacteur Infinite Horizon est décrite. La méthode tire parti d'un cadre personnalisé conçu et pince pour stabiliser la colonne vertébrale. La procédure normalisée et biomécanique des blessures paramètres entraînent des blessures suffisantes et durables.

Résumé

Alors que la majorité des humains blessures de la moelle épinière se produisent dans la moelle épinière cervicale, la grande majorité des recherches en laboratoire emploie des modèles animaux de lésions de la moelle épinière (SCI) dans lequel la moelle épinière thoracique est blessé. En outre, parce que la plupart lésions de la moelle de l'homme se produisent à la suite d'émoussée, non-pénétrant un traumatisme (accident de véhicule automobile, par exemple, des blessures sportives) où la moelle épinière est violemment frappé par de l'os déplacées ou des tissus mous, la majorité des chercheurs SCI sont d'avis que les plupart des modèles de blessures cliniquement pertinents sont ceux dans lesquels la moelle épinière est rapidement contusionné. ^{1 Par} conséquent, une étape importante dans l'évaluation préclinique de nouveaux traitements sur le chemin de la traduction humaine est une évaluation de leur efficacité dans un modèle de contusion au sein de SCI la moelle épinière cervicale. Ici, nous décrivons les aspects techniques et les résultats qui en résultent anatomiques et comportementales d'un modèle unilatéral contondante du cancer du col SCI qui emploie leInfini Horizon frappe des lésions médullaires.

Des rats Sprague-Dawley ont subi une laminectomie unilatérale du côté gauche au niveau de C5. Afin d'optimiser la reproductibilité des résultats biomécaniques, fonctionnels, et histologique du modèle des blessures, nous contus de la moelle épinière en utilisant une force d'impact de 150 kdyn, une trajectoire d'impact de 22,5 ° (animaux tourné à 22,5 °), et un point d'impact hors de la ligne médiane de 1,4 mm. La récupération fonctionnelle a été évaluée à l'aide du test du cylindre d'élevage, de test échelle horizontale, le toilettage de test et test de l'escalier modification de Montoya pour un maximum de 6 semaines, après quoi les moelles épinières ont été évalués histologiquement pour épargne matière grise et blanche.

Le modèle présenté ici donne des blessures cohérents et reproductibles des forces biomécaniques de la moelle épinière, une caractéristique importante de tout modèle expérimental SCI. Cela entraîne des dommages histologiques discret à la moitié latérale de la moelle épinière qui est en grande partie contenue à til côté ipsilatéral de blessure. La blessure est bien tolérée par les animaux, mais ne se traduisent par des déficits fonctionnels de la patte antérieure qui sont importants et soutenus dans les semaines suivant la lésion. Le modèle de lésion cervicale unilatérale présenté ici peut être une ressource pour les chercheurs qui souhaitent évaluer les thérapies potentiellement prometteuses avant la traduction humaine.

Protocole

1. Mettre en place: conception du cadre et de serrage pour tenir l'animal

1. Le cadre et le collier de tenir l'animal a été spécialement conçu pour accueillir l'horizon infini (IH) Spinal Cord Injury Impactor.
2. La base de la trame est une plate-forme en aluminium taillées dans les dimensions suivantes (30,2 cm x 20,3 cm x 1,3 cm) pour s'insérer dans le support de guide de table qui est livré en standard avec l'appareil IH (figure 1A).
3. Quatre plaques Flexaframe pied d'appui (Fisher Scientific, Toronto, ON) sont attachés à la plate-forme et de huit tiges de support Flexaframe (Fisher Scientific, Toronto, ON, 30,5 cm) sont assemblés à l'aide de huit connecteurs de soutien Flexaframe (figure 1B).
4. Deux autres connecteurs de soutien Flexaframe, attachés aux deux moyennes tiges, maison de la coutume fait est valable pour la pince (figure 1B).
5. L'angle par lequel la moelle épinière de l'animal est tourné par rapport à la verticale est établie par keeping une de la tige horizontale en place et faire varier la hauteur de l'autre tige horizontale (figure 2).
6. La pince est de 35,6 mm de long, 25,4 mm de haut et avec une mâchoire de 7,6 mm conçu pour agripper solidement au-dessous de l'apophyse transverse de C4 à C6 (figure 1C). Des détails supplémentaires sur la conception de serrage ont été décrites précédemment par Choo et al., 2009.

2. Chirurgie

1. Homme rats Sprague-Dawley (Charles River Laboratories) pesant 300-350 g ont été anesthésiés par l'isoflurane (4% pour l'induction et 2% pour la maintenance) dans de l'oxygène (1 L / min).
2. Une fois que les animaux sont sous le plan de l'anesthésie, l'animal est placé dans un cadre stéréotaxique (Kopf, Tujunga, CA).
3. Afin de minimiser les saignements lors de la procédure chirurgicale de 0,4 mL de lidocaïne (20 mg / ml; Bimeda - MTC Animal Health Inc, Cambridge, Ontario, Canada) avec de l'épinéphrine est injectée par voie intramusculaire dans le site chirurgical dans le dorsala région du cou l.
4. Une incision 4-5 cm ligne médiane dorsale est faite en utilisant un scalpel stérile (# 15), à partir de la base du crâne et s'étendant caudalement.
5. Stériles pince Adson sont utilisés pour disséquer sans ménagement par la musculature dorsale pour atteindre la colonne vertébrale, et un écarteur stérile Alm (Outils belle science, North Vancouver, BC) est insérée pour maintenir les muscles écartés.
6. En utilisant le scalpel n ° 15, les muscles recouvrant les lames de C4-C7 sont grattées, à partir de la ligne médiane et les balayant latéralement.
7. Une incision avec un scalpel stérile (# 15) est faite pour le muscle attaché aux apophyses transverses des deux côtés de la colonne vertébrale afin d'adapter la pince au-dessous des apophyses transverses de C4 à C6.
8. Avec une amende stérile à embout Friedman-Pearson Rongeur (Outils belle science, North Vancouver, BC), la gauche C5 lamina est soigneusement enlevée pour visualiser la durée et la moelle épinière.
9. Une tige d'un diamètre de 1,5 mm est glissé sous les braspour soutenir l'animal jusqu'à, augmentant ainsi la colonne vertébrale et légèrement faciliter l'insertion de serrage.
10. Monter la mâchoire de la pince stérile sur les apophyses transverses latéraux de C4 à C6 et serrer les vis.
11. Retirer l'écarteur Alm.

3. Spinal Cord Injury

1. Après la pince est montée sur l'animal, l'animal est déplacé vers l'élément de frappe IH.
2. La pince est inséré dans les supports métalliques sur les deux tiges du milieu de la trame qui ont été déposés sous un angle de 22,5 ° par rapport à l'horizontale (figure 2).
3. La prise en ciseaux qui permet les réglages de hauteur stable, (VWR, Mississauga, ON) est soulevée jusqu'à l'animal repose à plat.
4. Faire en sorte que la pince est horizontal en plaçant un niveau petit cylindre au-dessus de la pince et en serrant les vis. Il est important que toutes les vis sont bien serrées et la mise en place est rigide, sans aucun mouvement.
5. Le reste de la procédure se déroule en vertu d'un microscope (Leica MZ8).
6. Abaisser et visent la pointe de frappe (15 mm de diamètre, avec des bords arrondis) en utilisant le bouton de réglage vertical et les deux boutons de réglage horizontal sur l'impacteur IH jusqu'à ce que le centre de la pointe de frappe est en vol stationnaire au-dessus du sommet de l'apophyse épineuse C6.
7. Une fois la pointe de frappe est centré, tournez le bouton de réglage axe des y un et deux cinquième tour (1,4 mm) pour déplacer la pointe latéralement vers le côté gauche et l'axe des x bouton de réglage horizontale pour déplacer la pointe de frappe le centre de C5.
8. Abaissez la pointe jusqu'à ce qu'elle soit juste au-dessus de la dure-mère afin de vérifier que la pointe de frappe est le but de la moitié latérale de la substance grise.
9. Tournez le bouton de réglage vertical de deux tours à relever la pointe de 4 mm au-dessus de la dure-mère.
10. Assurez-vous que la zone d'impact est à sec en utilisant un coton-tige ou un bâtonnet.
11. Régler la force désirée à 150 kdyn sur le programme et cliquez sur "Expérience Démarrer" pour déclencher la frappe.
12. Après la blessure, la plaie est fermée en layers avec 5-0 points de suture vicryl. La buprénorphine (0,03 mg / kg SC, Temgésic; Schering-Plough Corporation de Kenilworth, NJ) et Saline (10 ml) est administré par voie sous cutanée deux fois par jour avant et pendant deux jours après la chirurgie. Les animaux sont surveillés de près deux fois par jour pendant 2 semaines et une fois par semaine pendant 6 semaines après la lésion.

4. Les résultats représentatifs

Twenty Nine mâles Sprague Dawley (Charles River Laboratories) pesant 300-350 g ont été blessés lors d'une mise en vigueur de 150 kdyn. La pointe de frappe visait 1,4 mm latéral de la ligne médiane, à un angle de 22,5 ° au large de la verticale. La force moyenne réelle était 155,55 ± 0,73 kdyn. Le déplacement moyen était de 1512,72 ± 27,86 um et la vitesse était 120,24 ± 0,52 mm / s (Figure 3).

Mesures issue du comportement

La récupération fonctionnelle a été évaluée en utilisant le test horizontale échelle, l'élevage de test cylindre, le toilettage de test,et modifié test de l'escalier Montoya ^1. Les animaux ont été formés avant la lésion et évalués aux semaines 2, 4 et 6 post-traumatiques. Il y avait des déficiences importantes subies membres antérieurs pendant toute la période expérimentale.

Essai échelle horizontale. Avant la blessure, les animaux ne fait 4,75 ± 0,73% sur les erreurs de la patte antérieure ipsilatérale lors de la traversée à travers l'échelle irrégulière interligne horizontal. Après la blessure, les animaux ont démontré des augmentations marquées dans le pourcentage d'erreurs des membres antérieurs. Les erreurs ipsilatérales pour cent des membres antérieurs étaient 26,97 ± 2,92%, 26,23 ± 2,84% et 22,06 ± 2,05% à 2, 4 et 6 semaines post-traumatiques, respectivement (figure 4A). Surtout, la dépréciation du membre antérieur sur ce test a été maintenue pendant les 6 semaines.

Élevage d'essai Cylindre. Le pourcentage de membres antérieurs homolatérale (à gauche + à la fois) utilisation lors de l'exploration a diminué de façon significative après la SCI.Avant la blessure, les animaux utilisés à des membres antérieurs du ipsilatéral 75,12 ± 2,25%. Après la blessure des animaux utilisés à des membres antérieurs du ipsilatéral 8,59 ± 1,80% à 2 semaines, 14,25 ± 2,65% à 4 semaines et 11,76 ± 2,66% à 6 semaines (figure 4B).

Mis à jour le test de l'escalier Montoya. Le nombre de pastilles récupérées avec la patte antérieure ipsilatérale diminué de façon spectaculaire après la blessure. Avant la blessure, les animaux recueillis 84,85 ± 2,88% des récompenses alimentaires. Toutefois, aux semaines 2, 4 et 6 post-traumatiques, les animaux récupérés seulement 30,91 ± 4,03%, 28,94 ± 4,38% et 25,86 ± 3,09% des pellets (figure 4C).

Toilettage de test. Il y avait des baisses dramatiques dans les scores de toilettage après une blessure. Après SCI, les scores étaient ipsilatérales de toilettage 2 semaines: 2,00 ± 0,17, 4 semaines: 1,83 ± 0,17 et 6 semaines: 1,79 ± 0,11 (Figuré 4D).

Résultats histologiques

La matière blanche et économe matière grise. Un exemple d'une lésion de la moelle épinière à une force de 150 kdyn, angle de 22,5 ° et visent latérale de 1,4 mm est présenté dans la Figure 5. La blessure a entraîné des dommages importants à la matière grise et blanche sur le côté ipsilatéral. Les deux cortico et des voies rubrospinal ont été blessés et 23 des 29 animaux ont subi des dommages du parenchyme contenues sur le côté ipsilatéral. L'étendue longitudinale de l'endommagement de la matière grise et blanche était de 2400 et 2400 rostralement caudale (figure 6). Lors de l'ajout des sections afin de fournir une estimation brute de la «propagation cumulative" d'épargner matière grise et blanche (2000 um rostrale et caudale de l'épicentre), du côté ipsilatéral eu seulement 51,8% de la substance blanche épargné et 39,7% de la matière grise rapport en restant sur ​​le côté controlatéral (figure 6).

Figure 1. Infini Horizon frappe des lésions médullaires. A. Impacteur Horizon Infini et global mis en place. B. Cadre mis en place. C. Close-up image de la pince pour la tenue de col de l'utérus apophyses transverses. D. Spécification (unité: pouces) de la pince. La tolérance suggérée <0,002 dans (Choo et al. 2009). Cliquez ici pour agrandir la figure .

Figure 2. A. Illustration cadre et correspondant mis en place pour atteindre la moelle épinière de rotation de 0 ° (neutre) ou B. 22,5 ° dans le but latérale de 1,4 mm.

Figure 3. Représentant vigueur et des graphiques de déplacement pour impacteur horizon infini. La flèche indique le temps que la pointe de frappe a atteint 20 kdyn et le moment où l'enregistrement du déplacement est déclenchée. La force réelle est lu à partir du pic de la courbe force en fonction du temps et le déplacement correspondant est calculé. Les graphiques ci-dessous illustrent un type 150 contusion kdyn, A. Déplacement vs graphique en temps, la Force vs B. graphe temps. Ces graphiques montrent que la force réelle obtenue était de 152 kdyn, et le déplacement de frappe dans la moelle a été mesurée à 1287 um. Cliquez ici pour agrandir la figure .

Figure 4. Évaluations comportementales pour la force de 150 kdyn, angulation de frappe de 22,5 ° et l'objectif de 1,4 mm à gauche de la ligne médiane. A. Test de l'échelle horizontale. B. Test élevage Cylindre. C. mise à jour test de l'escalier Montoya. D. Toilettage de test. Le membre antérieur ipsilatéral entraîné importante et sustaiNed déficiences par rapport à la patte antérieure controlatérale.

Figure 5. Des images représentatives de la moelle épinière lésée de rostrales 1600 um à 1600 um caudal.

Figure 6. Évaluations histologiques. A. Pour cent de blanc et de matière grise épargné. Matière autour de 2000 um de l'épicentre du dommage a été en grande partie épargnée. B. cumulatif blanc et la matière grise au sein épargné 2000 um de l'épicentre de dommages. Le côté ipsilatéral avaient significativement moins épargné matière grise et blanche par rapport au côté controlatéral. Cliquez ici pour agrandir la figure .

Discussion

Dans cet article, nous décrivons un modèle contusion cervicale unilatérale en utilisant l'horizon infini (IH) frappe avec une force de 150 kdyn, un angle de 22,5 ° par rapport à la verticale, et un objectif latérale de 1,4 mm de la ligne médiane. Avec ces paramètres, nous étions en mesure de produire les déficits comportementaux subies dans le membre antérieur ipsilatéral avec une perturbation du parenchyme contenue en grande partie sur le côté ipsilatéral, où il est apparu que des dommages considérables eu lieu dan...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Nom de l'équipement	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Impactor Infinite Horizon	Precision Systems et de l'instrumentation	IH-0400
Tôle d'aluminium	Metalsupermarlets.com	APT6061/500
Des plaques d'appui de pied Flexaframe	Les pêcheurs scientifique	1466625Q
Tiges de support Flexaframe	Les pêcheurs scientifique	1466610GQ
Flexaframe Connecteurs de soutien	Les pêcheurs scientifique	1466620Q
Fixer une	Custom made		Choo et al., 2009
Détenteurs de métal	Custom made		Voir ci-dessus
Impactor pointe	Custom made		Diamètre: 1,15 mm
Cadre stéréotaxique	David Kopf Instruments	Modèle 900
Niveau Cylindre	Yijia OUTILS	YJ-SL0620
Microscope	Leica		Modèle #: MZ8
Ciseaux Laboratoire prise	VWR	12620-902