Un bioréacteur pression cyclique capable de soumettre des tissus de valves cardiaques à des conditions de pression physiologique et pathologique a été conçu. Un programme LabVIEW permet aux utilisateurs de contrôler l'ampleur de pression, l'amplitude et la fréquence. Ce dispositif peut être utilisé pour étudier la mécanobiologie des tissus de valves cardiaques ou des cellules isolées.
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Article de méthode
Conception d'un bioréacteur pour la pression cyclique Ex Vivo Étude des valves cardiaques aortiques
Dans cet article
Résumé
Résumé
La valve aortique, situé entre le ventricule gauche et l'aorte, permet la circulation sanguine unidirectionnelle, en prévenant le refoulement dans le ventricule. Des tracts de la valve aortique sont composés de cellules interstitielles en suspension dans une matrice extracellulaire (MEC) et sont bordées d'une monocouche de cellules endothéliales. La vanne résiste à un environnement difficile et dynamique et est constamment exposée à de cisaillement, de flexion, la tension et de compression. La recherche a montré des lésions calcifiées dans les valves malades se produisent dans les zones de fortes contraintes mécaniques en raison de perturbations ou dommages endothéliales matrice interstitielle 1-3. Par conséquent, il n'est pas surprenant que les études épidémiologiques ont montré une pression artérielle élevée est un facteur de risque important dans l'apparition de la maladie de valve aortique 4.
La seule option de traitement actuellement disponibles pour la maladie de valve est le remplacement chirurgical de la valve malade par une valve mécanique ou bioprothèse 5. Une meilleure compréhension de la biologie de soupape en réponse à des stress physiques aiderait élucider les mécanismes de la pathogenèse de la vanne. En retour, cela pourrait aider dans le développement de thérapies non invasives telles que l'intervention pharmaceutique ou de prévention. Bioréacteurs Plusieurs ont déjà été développés pour étudier la mécanobiologie des valves cardiaques natives ou conçu 6-9. Bioréacteurs pulsatile ont également été développées pour étudier une gamme de tissus, y compris le cartilage 10, 11 os et de la vessie 12. Le but de ce travail était de développer un système de pression cyclique qui pourrait être utilisée pour élucider la réponse biologique de tracts de la valve aortique à des charges de pression accrue.
Le système se composait d'une chambre d'acrylique dans lequel placer des échantillons et de produire une pression cyclique, vannes à membrane viton électrovannes pour contrôler la synchronisation du cycle de pression, et un ordinateur pour contrôler des appareils électriques. La pression a été contrôlée à l'aide d'un transducteur de pression, et le signal a été conditionné à l'aide d'un conditionneur cellule de charge. Un programme LabVIEW réglementées utilisant la pression d'un périphérique analogique à la pompe à air comprimé dans le système au taux approprié. Le système a imité les niveaux dynamiques de pression transvalvulaire associés à la valve aortique, une vague en dents de scie produit une augmentation progressive de la pression, typique du gradient de pression transvalvulaire qui est présent à travers la vanne pendant la diastole, suivie d'une forte chute de pression représentant ouverture de la vanne de systole. Le programme LabVIEW permet aux utilisateurs de contrôler l'ampleur et la fréquence de la pression cyclique. Le système a été en mesure de soumettre des échantillons de tissus à des conditions de pression physiologique et pathologique. Ce dispositif peut être utilisé pour accroître notre compréhension de la façon dont les valves cardiaques de réagir aux changements dans l'environnement local mécanique.
Protocole
1. Récolte et préparation des tissus
- Valves aortiques doivent être prélevés sur des porcs adultes pesant pas plus de £ 120 immédiatement après la mort.
- Lavez les vannes à deux reprises avec une solution saline tamponnée phosphate stérile (PBS) et le transport au laboratoire sur la glace.
- Toutes les étapes suivantes devraient être effectuées dans des conditions stériles.
- Assurez-vous que des tracts ne montrent aucun signe de dégénérescence, déchirure ou de calcification. Retirer des tracts de la racine aortique en coupant 1 / 3 de la distance de l'anneau.
- Placez des dépliants dans les puits individuels d'une plaque de six puits et incuber pendant la nuit avec 3ml de Dulbecco Modified Eagle Médium complété avec une solution anti-biotic/anti-mycotic 1% et 10% de sérum fœtal bovin à 37 ° C et 5% de CO 2.
- Comme alternative, les cellules isolées peuvent être ensemencées dans des plaques de culture à six puits et utilisée dans le dispositif de pression. L'isolement des cellules endothéliales et les cellules de soupape interstitielle peut être effectuée comme décrit précédemment 13, 14.
2. Les études de pression
- Un système de pression faits sur mesure a été conçu pour étudier les effets de la pression cyclique mécanobiologique sur le tissu de la valve aortique 15.
- Connectez-vous à l'ordinateur et ouvrez le programme LabVIEW (Figure 1).
- Calibrage:
- Avant l'expérimentation, le système doit être correctement étalonné.
- Branchez l'alimentation sur le circuit. Ceci fournit la puissance aux électrovannes qui contrôlent le flux d'air entrant et sortant de la chambre.
- Assurez-vous que l'air comprimé est connecté au système et ouvrir l'alimentation en air à la vitesse plein.
- Allumez l'amplificateur de signal. Assurez-vous que la lecture de tension est de 0,00. Ajustez si nécessaire
- L'interface LabVIEW a un commutateur marqué «TEST / RECORD". Assurez-vous que le commutateur est réglé sur "TEST". Cliquez sur le bouton marqué "Air Supply" pour ouvrir l'électrovanne d'admission.
- En utilisant le régulateur de pression de gaz, sous pression de la chambre à air comprimé à 1 PSI. La pression dans la chambre peut être lu en utilisant le manomètre numérique situé à l'arrière plaque d'extrémité de la chambre. Une fois que la pression a équilibré, d'enregistrer la lecture de tension de l'amplificateur de signal. Répétez l'opération pour PSI 2, 3, 4 et 5.
- Construire une courbe d'étalonnage de pression fonction de la tension. La pression doit être converti à partir PSI mmHg. L'équation à partir du graphique peuvent être placés dans le code du programme LabVIEW
- Retirez la plaque avant en aluminium de la chambre de pression et de pulvérisation de la chambre avec 70% d'éthanol. Laisser un minimum de 10 minutes pour permettre à des vapeurs d'éthanol résiduel se dissipe.
- Placer la plaque de six puits contenant les échantillons dépliant dans la chambre et de remplacer la plaque frontale. S'assurer que le joint est étanche par serrage des écrous situés sur les quatre tiges filetées (situés à chaque coin de la plaque d'extrémité) à la main. Placez la chambre de pression dans l'incubateur 37 ° C. Un diagramme schématique de la chambre de pression est montré dans la figure 2.
- L'interface invite l'utilisateur à fournir la quantité de temps entre les cycles du système d'air comprimé d'entrée et de sortie. Ceux-ci devraient être mis à 0.6s et 0.4s pour imiter les conditions systolique et diastolique, respectivement, à une fréquence de 1Hz. L'utilisateur doit également entrer un chemin vers le fichier de données.
- Dans LabVIEW, cliquez sur Exécuter et passer le «TEST / RECORD" toggle pour "enregistrer".
- Assurez-vous que la pression est au niveau souhaité à l'aide du graphique de l'interface LabVIEW. La pression peut être ajustée en utilisant le régulateur de pression de gaz.
- Exécutez le programme pour la longueur de temps désirée.
- Une fois l'expérience terminée, cliquez sur le bouton d'arrêt sur LabVIEW, éteignez l'alimentation en air et d'ouvrir la soupape d'échappement sur la chambre de pression.
- Retirer la plaque d'extrémité avant de la chambre et récupérer des échantillons de plaque de six puits contenant. Les échantillons peuvent maintenant être analysées pour l'expression des gènes, l'expression des protéines, l'histologie, les propriétés mécaniques etc
3. Les résultats représentatifs:
Le système de pression est capable de simuler les pressions maximales observées sous transvalvulaire normotendus, de phase I et II des conditions hypertendus. Cependant, la pression n'a pas été capable d'imiter le gradient de pression systolique, qui est essentiellement nul in vivo. Fréquence est maintenue à 1Hz, avec un temps d'entrée d'air de 0,6 s et un temps d'échappement de 0,4 s. Courbes de pression représentant des conditions de pression normales et élevées obtenues par le système peut être vu dans la figure 3.
Figure 1: Capture d'écran de l'interface LabVIEW.
Figure 2: Schéma de la vue la pression chambre A. isométrique de la chambre de pression; B. Vue latérale de la chambre de pression;C. Vue du haut de la chambre de pression.
Figure 3: Graphe de simulation de pression dans la chambre de pression en (A) normotendus, (B) Stade I hypertendus, et (C) Phase II des conditions hypertendus.
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Discussion
Le système de pression avec succès exposés tracts valve aortique à des pressions cycliques qui sont représentatifs de la pression diastolique transvalvulaire. Toutefois, il n'a pas été capable d'imiter la pression systolique transvalvulaire, comme la seule pression a chuté à 40 mmHg. Pression transvalvulaire est la différence entre la pression dans l'aorte ascendante et le ventricule gauche. Pendant la diastole, lorsque le clapet est fermé, la différence de pression est 80mmHg dans des conditions normotendus...
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Déclarations de divulgation
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Remerciements
Les auteurs sont reconnaissants à Shad Schipke et Daniel Chesser pour leur aide à la conception et la fabrication du système et Myles Valtresa de l'aide pour la préparation du manuscrit.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Nom du réactif | Société | Numéro de catalogue | Commentaires (optionnel) |
| DMEM | Sigma | D5671 | |
| PBS Dulbecco | Sigma | D5652 | |
| Solution Anti-mycotic/antibiotic | Sigma | A5955 | |
| Sérum de veau fœtal | ThermoScientific | SH30070 | |
| Vannes à membrane Viton électrovanne | McMaster Carr | 4868K11 | |
| Capteur de pression | Omega Engineering, Inc | PX302-200GV | |
| Conditionneur de cellule de charge | Encore Electronics, Inc | 4025-101 | |
| Acquisition de données (DAQ) Module | Measurement Computing | PMD1608 |
Références
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Réimpressions et autorisations
