Assay Sphéroïde pour mesurer le TGF-β induit Invasion

Résumé

Un test pour mesurer quantitativement Transforming Growth Factor (TGF)-β-induite invasion dans des gels de collagène en 3 dimensions est décrite. Ce test prend avantage de la série MCF10A de lignées cellulaires, qui représentent les différentes étapes du développement du cancer du sein. Cette méthode peut être adoptée pour être utilisé avec d'autres lignées cellulaires et pourraient être utilisées pour étudier d'autres activateurs ou des inhibiteurs potentiels de l'invasion.

Résumé

Le TGF-β a opposés rôles dans la progression du cancer du sein en agissant comme un suppresseur de tumeur dans la phase initiale, mais stimulant l'invasion et les métastases à ^1,2 ultérieurement. Par ailleurs, le TGF-β est fréquemment surexprimé dans le cancer du sein et son expression est corrélée à un mauvais pronostic et les métastases ^3,4. Les mécanismes par lesquels le TGF-β induit l'invasion ne sont pas bien comprises.

Le TGF-β provoque ses réponses cellulaires via le TGF-β de type II (TβRII) et de type I (TβRI) récepteurs. Sur le TGF-β induit la formation de complexes hétéromériques, TβRII phosphoryle la TβRI. Le TβRI activé initie sa voie de signalisation intracellulaire canonique par Smad récepteurs phosphorylant (R-Smad), c'est à dire Smad2 et Smad3. Ces activé R-Smad former des complexes avec les hétéromériques Smad4, qui s'accumulent dans le noyau et régulent la transcription des ⁵ gènes cibles. En plus des déjà described voie Smad, les résultats activation du récepteur dans l'activation de plusieurs autres non-Smad voies de signalisation, par exemple Mitogen protéine kinase activée (MAPK) voies ^6.

Pour étudier le rôle du TGF-β dans les différents stades du cancer du sein, nous avons fait usage du système de pile à MCF10A. Ce système est constitué de cellules MCF10A1 spontanément immortalisé sein (M1) épithéliales ^7, le H-Ras transformée M1 dérivés MCF10AneoT (M2), qui produit des lésions précancéreuses chez les souris ^8, et le M2 MCF10CA1a dérivés (M4), qui a été établi à partir xénogreffes M2 et les formes de haute qualité avec des carcinomes de la capacité à métastaser au poumon ^9. Cette série offre MCF10A la possibilité d'étudier les réponses des cellules avec différents grades de malignité qui ne sont pas biaisées par un fond génétique différent.

Pour l'analyse du TGF-β induite par l'invasion, nous avons généré homotypique MCF10A cellules sphéroïdes embe culturesdded dans une matrice de collagène 3D in vitro (figure 1). Ces modèles ressemblent tumeurs humaines in vivo par l'établissement d'un gradient d'oxygène et de nutriments, résultant en cellules actives et invasives sur les cellules à l'extérieur et de repos ou même nécrotiques dans l'intérieur du ¹⁰ sphéroïde. Sphéroïde tests basés ont également été montré pour une meilleure résistance aux médicaments que récapituler cultures en monocouche ^11. Ce système MCF10 modèle 3D nous a permis d'étudier l'impact du TGF-β de signalisation sur les propriétés invasives des cellules mammaires à différents stades de malignité.

Protocole

1. Préparation de la solution méthocel (500 ml)

1. Autoclave 6 g de méthylcellulose dans une bouteille de 500 ml contenant un agitateur magnétique.
2. Dissoudre la méthylcellulose dans 250 ml de DMEM/F12 sans sérum préchauffé (60 ° C) pendant 20 min.
3. Ajouter 250 ml de DMEM/F12 (RT) contenant du sérum de cheval à 10%. Mélanger la nuit (4 ° C).
4. Effacer la solution par centrifugation (5000g, 2h, 4 ° C).
5. Prenez la solution claire très visqueux dans un nouveau tube (environ 90-95% de la solution mère).
6. Conserver à 4 ° C jusqu'à utilisation.

2. La culture Sphéroïde

1. Préparer une solution à 20% Methocel (10 ml et 40 méthocel milieu de croissance ml).
2. Laver les cellules deux fois avec PBS, ajouter 0,1% de trypsine et les cellules incuber à 37 ° C
3. Resuspendre les cellules dans un milieu de croissance et de compter les cellules.
4. Préparer une suspension de 10 000 cellules par ml dans méthocel 20%.
5. Ajouter la suspension cellulaire à la S 96 puits à fond rondplaques USPENSION (100 pi par puits).
6. Le jour suivant, vérifiez la formation sphéroïde dans les plaques de suspension. Sphéroïdes sera prêt à l'emploi après 1-3 jours.

3. Préparation du collagène

1. Préparer sur la glace une solution de collagène 8 ml, 1 ml PBS 10X, 1 ml de NaOH 0,1 N et 3 gouttes de HCl 0,1 N. Vérifiez si le pH est de 7,4 en repérant certains de la solution sur les bandes indicatrices de pH. Ajuster le pH si hors de portée.
2. Ajouter 50 ul de solution de collagène neutralisé dans le puits d'une plaque à 96 puits
3. Incuber à 37 ° C jusqu'à ce que le collagène est solidifié (90 min).
4. Préparer méthocel-collagène-ligand des solutions sur la glace: pour chaque pipette ligand 1 partie de la solution de collagène. Ajouter 20 ng par ml de TGF-β collagène. Après dilution avec méthocel et la diffusion sur les différentes couches, la concentration finale de TGF-β sera de 5 ng / ml Mélanger au vortex. Ajouter une partie de méthocel-solution. Mélanger au vortex.

4. Sphéroïde intégrerDing

1. Placez une extrémité 200 pi, qui a environ 5 mm de la pointe coupée, sur une pipette 200 pi. Aspirez une sphéroïde avec la pipette et soigneusement Répartir le milieu dans une assiette vide. Regardez si le sphéroïde reste à l'intérieur de la pointe. Le sphéroïde est visible comme un point blanc. Sans relâcher le piston, sucer jusqu'à 100 ul collagène méthocel mélange et se dispenser de l'ellipsoïde dans le mélange de collagène dans un revêtus de collagène de 96 puits. Faites cela pour 12 sphéroïdes pour chaque condition.
2. Laissez collagène solidifier au moins 30 minutes à 37 ° C
3. Retirer les bulles d'air avec une pointe de 200 pi.
4. Ajouter 50 ul de milieu avec du sérum de 1,6% et les inhibiteurs dissous dans du DMSO. Pour le SB-431542 ajouter 4 ul de la solution mère (10 mm) à 1 ml de milieu. Après la diffusion, la concentration finale de l'inhibiteur sera de 10 uM. Le TGF-β et les inhibiteurs maintiendra le cap de l'expérimentation. Prenez des photos de sphéroïdes sous le microscope en utilisant un grossissement de 40X.
5. Après 48h de stimulation par le TGF-β et / ou inhibiteurs, prendre des photos des sphéroïdes sous le microscope en utilisant un grossissement de 40X.
6. Mesurer la surface des sphéroïdes envahir après 2 jours et soustraire la zone de départ. Mesure de la surface d'un sphéroïde: Ouvrir l'image à partir du sphéroïde dans Adobe Photoshop Extended (figure 2A) et sélectionnez l'outil Sélection rapide (figure 2B). Le pointeur de la souris se transforme en un cercle avec un «plus» (+) signe (figure 2C). Tout en faisant glisser le curseur sur le sphéroïde, Photoshop reconnaître les frontières de la sphéroïde. Si une zone à l'extérieur de l'ellipsoïde est sélectionné, cette région ne peut être exclu de la sélection en appuyant sur la touche Alt ou en utilisant l'outil de sélection négative qui est indiqué par un signe - dans la barre d'outils (). Le curseur se transforme en un cercle avec un «moins» (-) signe et en faisant glisser le curseur sur la zone sélectionnée à tort, cette zone est retiré de la sélection (figure 2D). Si nécessaire, plusieurs régions peuvent être sélectionnées en appuyant sur le ShBouton ift. Pour travailler avec plus de précision, de la taille du pointeur de la souris peut être ajustée en changeant le diamètre pinceau dans la barre d'outils (figure 2e). Lorsque le sphéroïde entier est sélectionné, la zone de la sélection est calculée par l'analyse-mesure dans la barre de menu ou en appuyant sur Ctrl + Maj + M (figure 2F). La fenêtre d'enregistrement de mesure apparaîtra indiquant le nom du fichier et le domaine de la sélection en pixels, ainsi que d'autres données (figure 2G). Si plusieurs sélections sont mesurées, la première ligne indique la somme de tous les domaines. Les mesures des sélections individuelles sont présentées dans les lignes ci-dessous. Les données de toutes les mesures peuvent être exportées dans un fichier texte et ouvert dans Excel.

5. Les résultats représentatifs:

Un exemple de l'essai sphéroïde MCF10A1 (M1) cellules mammaires normales épithéliales, H-Ras transformée MCF10AneoT (M2) et des cellules dérivées de M2 ​​MCF10CA1a (M4) est donnée dans la Figure 3. Cellules M1 a montré que l'invasion faible sansstimulation, mais envahie significativement meilleure lors de la stimulation par le TGF-β. En revanche, le RAS-transformé M1-M2 dérivés ont envahi déjà efficacement sans plus de stimuli, et ce fut encore augmenté fois 4-5 lors du TGF-β traitement. Cellules M4 a montré la plus forte invasion, à la fois avec et sans le TGF-β plus.

Ensuite, nous avons examiné si nous pouvions interférer avec le TGF-β induite par l'invasion de ce modèle sphéroïde en utilisant des inhibiteurs chimiques. À cette fin, nous avons utilisé le SB-431 542, un analogue de l'ATP et inhibiteur sélectif de l'activité kinase de TβRI, ainsi que l'activine de type IB récepteur (ActRIB) et l'activine receptor-like kinase (ALK) 7 ^12. Comme prévu, le SB-431542 inhibe puissamment le TGF-β induit l'invasion de M1, M2 et M4 cellules (Fig. 4), indiquant que le TGF-β invasion induite est TβRI-kinase dépendante. En outre, l'invasion basale des sphéroïdes a également été fortement inhibée, ce qui suggère que l'invasion basale est également deindépendante sur le TGF-β.

Organigramme Figure 1. De l'analyse 3D sphéroïde. Tout d'abord, les cellules sont plaquées sous conditions non-adhérentes en plaques suspensions en forme de U. Cellules attestation globale en sphéroïdes multcellular et peuvent être intégrés dans une matrice de collagène. Dans cette matrice de collagène, ils sont capables d'envahir.

Figure 2. Quantification de la zone des sphéroïdes en utilisant Adobe Photoshop Extended. (A) L'image du sphéroïde est ouvert dans Adobe Photoshop élargie du (B) Choix de l'outil de sélection rapide (C) Glisser le curseur sur le sphéroïde pour sélectionner la zone du sphéroïde (D) Suppression d'une zone incluse wongly utilisant le négative outil Sélection rapide (E) Ajustement de la taille du pinceau de l'outil Sélection rapide pour sélectionner plus précisément la zone (F) Sélection de laMesure commande à enregistrer (G) Exemple d'un enregistrement de la mesure.

Figure 3. TGF-β induite par l'invasion de sphéroïdes spontanément immortalisé MCF10A1 (M1) (A), RAS-transformé MCF10AneoT (M2 (B) et son dérivé métastatique MCF10CA1a (M4) (C). M1, M2 et M4 sphéroïdes embarqué en collagène ont été traités avec 5ng/ml du TGF-β pour les 48h comme indiqué. AC images représentant prises à la journée d'intégration et deux jours plus tard. D invasion relative a été quantifiée comme différence région le jour de moins 2 jours 0. Les résultats sont exprimés en moyenne ± SD Adaptée à partir de ^13.

Invasion de la figure 4. Sphéroïde basocellulaire et le TGF-β-induite est inhibée bSB-431542 Y. Sphéroïdes M1, M2 et M4 ont été intégrés dans le collagène et traités avec le TGF-β 5ng/ml et / ou 10 uM SB-431 542 comme indiqué. Images représentant prises après 2 jours (A). L'invasion relative a été quantifiée comme différence région le jour de moins 2 jours 0 (B). Les résultats sont exprimés en moyenne ± SD Adaptée à partir de ^13.

Discussion

Nous avons établi un modèle dans lequel sphéroïde MCF10A1 cellules malignes et de ses dérivés envahissent dans une matrice de collagène de manière TGF-β-dépendante. Tout d'abord, sphéroïdes sont formés dans les plaques rondes de 96 puits de suspension en bas, en présence de méthylcellulose. Bien sûr, aussi en forme de U en poly-HEMA plaques revêtues peuvent être utilisés à cette fin. La méthylcellulose est absolument nécessaire dans cette étape, puisque les cellules vont mourir en l'absence de méthylcellulose. L...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Nom du réactif	Société	Numéro de catalogue	Commentaires (optionnel)
Méthyl-cellulose	Sigma-Aldrich	M0512
PureCol	Avancé Biomatrix	5005-B
bandes indicatrices de pH	Merck	9533
96 puits de suspension plaques	Greiner Bio-One	650 185
96 puits d'adhésion TC plaques	Greiner Bio-One	655 180