Visualisation des Caenorhabditis elegans Utilisation du colorant lipophile Vital, Dii

Summary

Nous présentons une méthode pour visualiser les cuticules en direct C. elegans En utilisant les colorants lipophiles rouge fluorescent DII (1,1 '-dioctadécyl-3, 3,3', 3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate), qui est couramment utilisé dans C. elegans Pour visualiser les neurones écologiquement exposés. Avec ce protocole optimisé, les structures des ailes du nez et annulaire cuticulaires sont colorés par DII et observées par microscopie composé.

Abstract

La cuticule de C. elegans est une structure hautement résistante qui entoure l'extérieur de ^1-4 animaux. La cuticule protège non seulement l'animal de l'environnement, mais détermine aussi la forme du corps et joue un rôle dans la motilité ^4-6. Plusieurs couches sécrétées par les cellules épidermiques comprennent la cuticule, y compris une couche lipidique externe ^7.

Crêtes circonférentielle dans la cuticule appelé pattern anneaux de la longueur de l'animal et sont présents pendant toutes les étapes du développement ^8. Alae sont des crêtes longitudinales qui sont présents lors des étapes spécifiques du développement, y compris L1, Dauer, et les stades adultes ^2,9. Des mutations dans les gènes qui affectent l'organisation du collagène cuticulaire peut modifier la structure et la morphologie cuticulaires corps animal ^5,6,10,11. Alors que l'imagerie par microscopie cuticulaires composé avec l'optique DIC est possible, les méthodes actuelles qui mettent en évidence les structures cuticulaires comprennent fluorescentescent l'expression du transgène ^{12, 13} coloration des anticorps, et la microscopie électronique ^1. Étiqueté de germe de blé agglutinine (WGA) a également été utilisé pour visualiser les glycoprotéines cuticulaires, mais il est limité dans la résolution plus fine des structures cuticulaires ^14. Coloration de la surface de la cuticule en utilisant un colorant fluorescent a été observée, mais jamais caractérisés en détail ^15. Nous présentons une méthode pour visualiser en direct la cuticule C. elegans utilisant le colorant rouge fluorescent lipophile DII (1,1 '-dioctadécyl-3, 3,3', 3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate), qui est couramment utilisé en C. elegans pour visualiser les neurones écologiquement exposés. Ce protocole optimisé pour la coloration de Dii est une méthode simple et robuste pour la visualisation haute résolution fluorescentes d'anneaux, du nez, vulve, queue du mâle, et la queue hermaphrodites pic en C. elegans.

Protocol

1. Préparation de DiI tache

1. Préparer une solution stock de 20 mg / mL DII (Biotium, Inc, Hayward, CA) dans le DMF. Dii est sensible à la lumière, afin de protéger de la lumière DiI en enveloppant dans du papier.
2. Créer une dilution de travail de DiI en ajoutant 0,6 uL DiI stocks d'399,4 uL M9 pour chaque population. Cela devrait donner une dilution finale de travail de 30 ug / ml dans le DiI M9. Cela peut être étendu pour la coloration des populations multiples simultanément. Bouclier DiI de la lumière en enveloppant le tube (s) au fleuret.

2. Préparation de nématodes

1. Utilisez une plaque de 60 mm conte....

Discussion

La méthode de coloration DiI présenté ici permet d'une façon relativement rapide et pratique pour visualiser la cuticule chez C. elegans. En réorientation et l'optimisation d'une méthode couramment utilisée pour l'image écologiquement exposés neurones sensoriels ^15,17, Dii peut être utilisé pour fluorescence tache deux ailes du nez et des structures annulaires (figures 1 et 2), ainsi que la vulve, queue du mâle, et la queue hermaphrodites pic (Figure 3). Nous avons trouvé que la solut.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Réactifs	Synonymes	Société	Numéro de catalogue	Commentaires
DiI	1,1 '-dioctadécyl-3, 3,3', 3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate	Biotium, Inc	60010	Dilution de stock: 20 mg / ml dans le DMF dilution de travail: 30 mg / ml
DMF	Diméthylformamide	Sigma-Aldrich, Inc	D4551
Triton X-100	Octylphénoxypolyéthoxyéthanol	VWR International, LLC.	EM-9410
M9	22mm KH 2 PO 4, 42mm Na 2 HPO 4, 86mm de NaCl, 1 mM MgSO 4
NGM	Milieu de croissance des nématodes	IPM Scientific, Inc	11006-501	Peut être préparé en suivant le protocole de gélose NGM 18
L'agar-agar		EMD Chemicals, Inc	1,01614	4% dans de l'eau
Lévamisole	Chlorhydrate de lévamisole	Sigma-Aldrich, Inc	31742	100 M - 1 mM lévamisole tel que requis
Lames de microscope		VWR International, LLC.	16005-106
Lamelles de microscope		VWR International, LLC.	16004-302
Champ composé		Carl Zeiss, Inc	A1m	Utiliser des objectifs pour répondre aux besoins de l'expérience
TRITC ou autre filtre compatibles		Chroma Technology Corp	49005	HE - DsRed (TRITC/Cy3) a des ratés ensemble de filtres