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Les protéines membranaires (les députés) jouent un rôle essentiel dans de nombreux processus physiologiques tels que le pompage des molécules spécifiques à travers la bicouche membranaire contraire imperméable qui entoure toutes les cellules et les organelles. Altérations de la fonction du résultat de députés dans plusieurs maladies et affections humaines, ainsi, une compréhension complexe de leurs structures demeure un objectif essentiel pour la recherche biologique. Cependant, la détermination des structures de députés demeure un défi important souvent issus de leur hydrophobicité.
Les députés ont d'importantes régions hydrophobes incorporé dans la bicouche. Les détergents sont fréquemment utilisés pour solubiliser ces protéines de la bicouche générant une micelle protéines de détergent qui peuvent ensuite être manipulés d'une manière semblable que les protéines solubles. Traditionnellement, les essais de cristallisation se faire en utilisant un mélange de protéines de détergent, mais ils résistent souvent à produire des cristaux de cristallisation ou de mauvaise qualité. Ces problèmes surviennent en raison de lal'incapacité du détergent pour bien imiter la bicouche résultant en une mauvaise stabilité et de l'hétérogénéité. En outre, les boucliers de détergent à la surface hydrophobe de la MP en réduisant la surface disponible pour les contacts de cristal. Pour contourner ces inconvénients députés peut être cristallisé dans les médias lipidique, qui reproduit plus fidèlement leur environnement endogène, et est récemment devenu une technique de novo pour la cristallisation MP.
Lipidique phase cubique (LCP) est une bicouche lipidique en trois dimensions pénétré par un système interconnecté de canaux aqueuse à 1. Bien monooléine est le lipide de choix, les lipides connexes tels que monopalmitolein et monovaccenin ont également été utilisés pour faire LCP 2. Les députés sont incorporés dans le LCP où ils diffusent en trois dimensions et des noyaux de cristal nourrir. Un grand avantage de la LCP est que la protéine reste dans un environnement plus natif, mais la méthode a un certain nombre d'inconvénients techniques, y compris visc hauteosity (nécessitant des appareils spécialisés) et des difficultés dans la visualisation et la manipulation de cristal 3,4. En raison de ces difficultés techniques, nous avons utilisé un autre support lipidique pour la cristallisation-bicelles 5,6 (figure 1). Bicelles sont des mélanges de lipides / amphiphile formé par le mélange d'un lipide phosphatidylcholine (DMPC) avec un amphiphile (CHAPSO) ou un lipide à chaîne courte (DHPC). Dans chaque disque bicelle, les molécules lipidiques génèrent une bicouche tandis que la ligne amphiphile des molécules apolaires fournissant les bords des propriétés bénéfiques des deux bicouches et des détergents. Surtout, en dessous de leur température de transition, la protéine-bicelle mélanges ont une viscosité réduite et sont manipulés d'une manière semblable comme détergent solubilisées députés, rendant bicelles compatible avec les robots de cristallisation.
Bicelles ont été utilisées avec succès à cristalliser plusieurs protéines membranaires 5,7-11 (tableau 1). Cette collection croissantedes protéines démontre la polyvalence de bicelles de cristalliser deux hélice alpha et feuillet bêta députés à partir de sources procaryotes et eucaryotes. En raison de ces succès et la simplicité de mise en œuvre à haut débit, bicelles devrait faire partie de l'arsenal tous les cristallographe protéines de la membrane. Dans cette vidéo, nous décrivons la méthodologie bicelle et de fournir un protocole étape par étape pour la mise en place des essais de cristallisation à haut débit des députés purifiée en utilisant la robotique standard.