Article de méthode

L'extraction des lipides cellulaires pour ciblées dilution isotopique stable analyse de spectrométrie de masse chromatographie liquide-

DOI :

10.3791/3399

⸱

17 novembre 2011

 ,  , 
1Centers for Cancer Pharmacology and Excellence in Environmental Toxicology, University of Pennsylvania , 2Department of Pharmacology, University of Pennsylvania

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ce protocole démontrera l’extraction et l’analyse des acides gras bioactifs libres et estérifiés à partir de cellules. Les acides gras sont quantifiés avec précision à l’aide de la dilution d’isotopes stables, de la chromatographie liquide chirale, de la capture d’électrons, de l’ionisation chimique atmosphérique, de la surveillance de réactions multiples, de la spectrométrie de masse (SID-LC-ECAPCI-MRM/MS).

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le métabolisme des acides gras, tels que l’acide arachidonique (AA) et l’acide linoléique (LA), entraîne la formation de lipides bioactifs oxydés, y compris de nombreux stéréoisomères1,2. Ces métabolites peuvent être formés à partir d’acides gras libres ou estérifiés. Beaucoup de ces métabolites oxydés ont une activité biologique et ont été impliqués dans diverses maladies, notamment les maladies cardiovasculaires et neurodégénératives, l’asthme et le cancer3-7. Les lipides bioactifs oxydés peuvent être formés par voie enzymatique ou par des espèces réactives de l’oxygène (ROS). Les enzymes qui métabolisent les acides gras comprennent la cyclooxygénase (COX), la lipoxygénase (LO) et les cytochromes P450 (CYPs)1,8. Le métabolisme enzymatique entraîne la formation énantiosélective tandis que l’oxydation des ROS entraîne la formation racémique des produits.

Bien que ce protocole se concentre principalement sur l’analyse des métabolites bioactifs dérivés de l’AA et de certains métabolites dérivés de l’AL, il pourrait facilement être appliqué aux métabolites d’autres acides gras. Les lipides bioactifs sont extraits du lysat cellulaire ou des milieux par extraction liquide-liquide (l-l). Au début du processus d’extraction l-l, des étalons internes d’isotopes stables sont ajoutés pour tenir compte des erreurs lors de la préparation de l’échantillon. La dilution des isotopes stables (SID) tient également compte de toutes les différences, telles que la suppression des ions, que les métabolites peuvent rencontrer lors de l’analyse par spectrométrie de masse (MS)9. Après l’extraction, la dérivation avec un réactif de capture d’électrons (EC), le bromure de pentafluorylbenzyle (PFB), est utilisée pour augmenter la sensibilité de détection10,11. La surveillance des réactions multiples (MRM) est utilisée pour augmenter la sélectivité de l’analyse MS. Avant l’analyse MS, les lipides sont séparés à l’aide de la chromatographie liquide à haute performance (HPLC) en phase normale chirale. Les conditions HPLC sont optimisées pour séparer les énantiomères et les différents stéréoisomères des lipidessurveillés 12. Cette méthode spécifique LC-MS surveille les prostaglandines (PG), les isoprostanes (isoP), les acides hydroxyeicosatétraénoïques (HETE), les acides hydroxyoctadécadiénoïques (HODE), les acides oxoeicosatétraénoïques (oxoETE) et les acides oxooctadécadiénoïques (oxoEDE) ; cependant, les paramètres HPLC et MS peuvent être optimisés pour inclure tous les métabolites d’acides gras13.

La plupart des méthodes bioanalytiques actuellement disponibles ne prennent pas en compte la quantification séparée des énantiomères. Ceci est extrêmement important lorsqu’on essaie de déduire si les métabolites ont été formés ou non par des ROS. De plus, les rapports des énantiomères peuvent fournir des preuves d’une voie enzymatique spécifique de formation. L’utilisation de la SID permet une quantification précise des métabolites et tient compte de toute perte d’échantillon pendant la préparation ainsi que des différences rencontrées lors de l’ionisation. L’utilisation du réactif de capture d’électrons PFB augmente la sensibilité de détection de deux ordres de grandeur par rapport aux méthodes APCI conventionnelles. Dans l’ensemble, cette méthode, SID-LC-EC-ionization chimique à pression atmosphérique APCI-MRM/MS, est l’une des méthodes de quantification les plus sensibles, les plus sélectives et les plus précises des lipides bioactifs.

Protocole

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Mixages standard et standard internes

  1. Avant l’extraction des lipides, il faut préparer un mélange étalon (SM) et un mélange étalon interne (ISM). Pour le MS, aliquoter le volume équivalent de 1 μg de chaque étalon (25 au total) indiqué dans le tableau des réactifs ci-dessous, à l’aide d’une seringue calibrée, dans une fiole jaugée de 10 mL. Sécher les étalons sous azote et les reconstituer dans 10 mL d’acétonitrile (ACN). La concentration finale du mélange standard sera de 100 pg/μL. Diviser en aliquotes de 1 mL et conserver à -80 °C jusqu’à ce que vous en ayez besoin.
  2. À partir de ce mélange d’étalons, 6 dilutions d’étalons peuvent être effectuées pour un total de 7 étalons d’étalonnage (1 pg/ μL, 2 pg/ μL, 5 pg/ μL, 10 pg/ μL, 20 pg/ μL, 50 pg/ μL et 100 pg/ μL). Ces étalons doivent être analysés avec chaque lot d’échantillons préparé pour développer la courbe d’étalonnage utilisée dans l’analyse quantitative.
  3. Pour l’ISM, aliquoter le volume équivalent de 1 μg de chaque IS (14 au total) indiqué dans le tableau des réactifs ci-dessous dans une fiole jaugée de 10 mL, à l’aide d’une seringue calibrée, et sécher sous azote. Reconstituer l’ISM dans 10 mL d’ACN et diviser en aliquotes de 1 mL. La concentration finale de l’ISM doit être de 100 pg/μL. Il y a suffisamment d’ISM pour traiter 1000 échantillons.
  4. Stockez le SM et l’ISM à -80°C.

2. Collection de milieux et lysat cellulaire

  1. Pour chaque plaque de 10 cm de cellules adhérentes (~ 1 X 107), prélever 3 mL de milieu dans un tube à centrifuger en verre de 10 mL. Ensuite, lavez les cellules 2 fois avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS). Ajoutez 1 mL de PBS dans la plaque et grattez les cellules de la plaque et pipetez-les dans un deuxième tube à centrifuger en verre de 10 mL. À ce stade, des cellules et des supports peuvent être stockés si la procédure ne se poursuit pas à ce moment-là. Conservez les échantillons à -80 °C pour un stockage à long terme ou à -20 °C pendant moins d’une semaine.

3. Extraction des lipides à partir de milieux

  1. Des lipides bioactifs libres se trouvent dans les milieux cellulaires et ceux-ci sont facilement extraits avec une procédure d’extraction l-l en une étape. Au milieu collecté (2.1), ajouter 10 μL d’ISM. À ce moment, 8 tubes à centrifuger en verre supplémentaires de 10 ml doivent être étiquetés #0-7 pour les étalons d’étalonnage. Ajouter 3 mL de PBS dans chacun de ces tubes, puis ajouter 10 μL du SM approprié dans les tubes 1 à 7 (1-7 à partir de 1,1).
  2. Laisser l’ISM s’équilibrer dans chaque étalon et échantillonner pendant 10 minutes, puis ajouter 5 mL d’éther diéthylique. Les échantillons et les étalons d’étalonnage sont ensuite placés dans l’agitateur à basse vitesse pendant 30 minutes à température ambiante.
  3. Après agitation, tous les étalons et échantillons d’étalonnage sont centrifugés à 1935 x g pendant 10 minutes. Ensuite, à l’aide d’une pipette Pasteur, transférez la phase supérieure (organique) dans un tube à centrifuger en verre neuf de 10 mL et séchez-la sous azote.

4. Extraction des lipides du lysat cellulaire

  1. Faites tourner les échantillons de cellules dans les tubes à centrifuger en verre à 1935 X g pendant 5 minutes. Disposer du surnageant ; ajouter 2 ml de PBS dans chaque tube et agiter brièvement. Prélever 25 μL de l’échantillon pour la quantification des protéines. Les protéines totales seront utilisées pour la normalisation des lysats cellulaires.
  2. Ensuite, transférez la moitié du mélange lysat/PBS dans un tube à centrifuger en verre séparé de 10 ml. Ajouter 2 ml supplémentaires de PBS et 10 μL d’ISM à chaque échantillon. Suivez le processus d’extraction l-l décrit pour les supports en 3.2 et 3.3. Cette aliquote sera utilisée pour mesurer les lipides libres dans les cellules et éviter la dégradation alcaline des lipides, tels que les prostaglandines. Cette aliquote ne subira pas les étapes 4.3 et 4.4 décrites ci-dessous.
  3. La première étape du processus d’extraction des lipides estérifiés l-l nécessite l’ajout de 5 mL de CHCl3/MeOH (2:1) à chacun des échantillons. Les échantillons sont placés dans un agitateur à basse vitesse pendant 30 minutes. Après agitation, les échantillons sont centrifugés à 1935 x g pendant 10 minutes. Ensuite, à l’aide d’une pipette Pasteur, transférez la couche inférieure (organique) de l’extraction l-l dans un nouveau tube à centrifuger en verre de 10 ml et séchez l’échantillon sous azote.
  4. Les lipides estérifiés doivent être saponifiés avant d’être quantifiés. Une fois que les échantillons sont secs, ajoutez 0,5 mL de KOH 0,4N dans 80 % MeOH dans chaque tube. Les échantillons sont ensuite incubés à 60°C pendant 1 h. Après l’incubation, ajouter 2 mL de PBS. Ajustez le pH à 6 avec de l’acide HCl concentré (~30 μL). Ajouter 10 μL d’ISM à chaque échantillon. Le reste de la procédure est le même que l’extraction des lipides à partir de milieux et peut être suivi en 3.2 et 3.3.
  5. Si ces extractions sont effectuées en même temps que les échantillons de milieux, les mêmes étalons d’étalonnage peuvent être utilisés pour élaborer une courbe d’étalonnage ; cependant, si ces échantillons sont analysés à un autre moment, les étalons d’étalonnage doivent également être traités comme décrit aux sections 3.1 et 3.3.

5. Dérivation du pentafluorylbenzylbromure (PFB)

  1. Aux échantillons séchés et aux étalons d’étalonnage, ajoutez 100 μL de dichlorométhane anhydre (CH2, Cl2), puis 100 μL de N,N-diisopropyléthylamine à 20 % (v/v) dans du CH2Cl2 anhydre, et enfin 100 μL de PFB à 20 % (v/v) dans du CH2Cl2 anhydre.
  2. Après l’ajout de réactifs de dérivatisation, les échantillons sont vortexés, incubés à 60°C pendant 1 h et séchés sous azote. Les échantillons et les étalons d’étalonnage peuvent être conservés à -80 °C s’ils ne sont pas analysés immédiatement ou à -20 °C pendant une semaine au maximum.

6. Dilution d’isotopes stables Chromatographie liquide chirale Capture d’électrons Pression atmosphérique Ionisation chimique Spectrométrie de masse (SID-LC-ECAPCI-MS)

Analyse
  1. Les échantillons séchés et les étalons d’étalonnage sont reconstitués dans 100 μL d’hexane/éthanol (97:3). L’échantillon entier peut ensuite être transféré dans le flacon HPLC avec insert. Placez les échantillons dans l’échantillonneur automatique réfrigéré (4 °C) et créez une liste d’échantillons pour l’analyse.
  2. Ensuite, configurez les méthodes HPLC et MS à l’aide des paramètres décrits dans le tableau 1 et le tableau 2 ci-dessous. Le tableau 3 contient des informations spécifiques sur les composés, y compris l’énergie de transition et de collision (CE) MRM pour chaque lipide, ainsi que le temps de rétention estimé à partir de l’analyse Waters 2695/Thermo Fisher TSQ Quantum Ultra. L’EC est déterminée en ajustant chaque lipide individuel au cours du développement de la méthode.
  3. Une colonne Chiralpak AD-H (4,6 X 250 mm, 5 μ) chauffée à 30°C est utilisée pour la séparation de phase normale. La phase mobile de départ est composée à 98 % d’hexane et à 2 % de méthanol/isopropanol (1:1). Après la séparation HPLC, du méthanol est ajouté après la colonne (0,75 mL/min) pour éviter le dépôt sur l’aiguille Corona qui entraînerait une diminution de la sensibilité. Le MS est réglé en mode d’ions négatifs à l’aide de la source APCI. Si la source doit être remplacée par une aiguille Corona.
  4. Le premier échantillon qui doit être analysé est toujours un blanc d’hexane. Cela permettra d’équilibrer la colonne et de révéler s’il y a une contamination sur la colonne qui pourrait interférer avec l’étalon d’étalonnage et l’analyse de l’échantillon.
  5. Les échantillons suivants doivent être les échantillons de l’étalon d’étalonnage dans l’ordre de 0 à 7 (augmentation de la concentration de MS). Ces étalons seront utilisés pour créer une courbe d’étalonnage contenant le rapport entre l’aire normalisée/l’aire IS sur l’axe des y et la concentration ou la masse de l’étalon sur l’axe des ordonnées. À partir de l’équation y = mx + b dérivée de ce graphique, le rapport entre la surface de l’échantillon et la surface IS (y) peut être utilisé pour déterminer la quantité ou la concentration (x) de l’échantillon (inconnue).
  6. La quantité de lipides bioactifs présents dans le milieu peut être normalisée en fonction du volume total du milieu et la quantité de lipides présents dans le lysat cellulaire peut être normalisée en fonction du nombre total de cellules/plaque ou de la quantité totale de protéines/plaque. Des mesures doivent être prises au cours de l’article 4.1 du protocole pour s’assurer que les cellules sont comptées ou que les protéines sont quantifiées.

7. Résultats représentatifs :

Les chromatogrammes de la figure 1 sont représentatifs d’un profil lipidomique ciblé. Le premier panneau (figure 1A) montre le 13- et le 9-HODE ainsi que le 13- et 9-oxoODE correspondants, dérivés de l’acide linoléique. De plus, le 15-oxoETE, le métabolite oxydé de la 15-HETE, est également montré dans le deuxième panneau. Les deux panneaux inférieurs montrent 20-HETE et le 20-HETE-IS, [2H6]-20-HETE. La figure 1B montre la séparation et les transitions uniques déterminées pour les stéréoisomères HETE qui résultent de l’oxydation enzymatique de AA ou par ROS. La figure 1C est une représentation des PG, des isoP et des LTB4. Certaines normes n’ont pas de SI deutéré disponible dans le commerce ; par conséquent, un IS dont le temps de rétention est similaire est utilisé pour la quantification. Par exemple, [2H8]-12(S)-HETE est utilisé pour quantifier les espèces 11-HETE et 8-HETE en plus des espèces 12(R)-HETE et 12(S)-HETE.

D’après les chromatogrammes représentatifs, il est évident qu’il y a un petit décalage dans la rétention du SI deutéré par rapport à l’étalon non marqué. Ce passage à un temps de rétention plus tardif est le résultat de l’interaction du deutérium avec la colonne de phase normale. Le deutérium est plus polaire que l’hydrogène ; Par conséquent, il y a une interaction plus forte avec la phase normale de la colonne. Si cette séparation avait lieu à l’aide d’une colonne de phase inversée, le décalage se ferait vers un temps de rétention plus précoce, car une fraction plus polaire aurait une interaction plus faible avec la phase inverse.

figure-protocol-1
Graphique 1. Cette figure est un exemple représentatif d’une analyse lipidomique ciblée. La figure 1A montre les chromatogrammes ioniques totaux (TIC) pour plusieurs métabolites oxydés LA et AA, y compris le 13-oxoODE et le 9-oxoODE dans le premier panneau, le 15-oxoETE dans le deuxième panneau, le 13-HODE et le 9-HODE (panneaux 3 et 5) et le 20-HETE (panneau 7). Les HODEs et 20-HETE ont un IS deutéré correspondant dans le panneau ci-dessous (4, 6 et 8). Les TICs de la figure 2B montrent la séparation et les transitions uniques des stéréoisomères HETE dérivés de l’AA. La figure 2C est une représentation des PG, des isoP et des LT. L’énergie de collision (CE), les transitions MRM et le temps de rétention (RT, min) ont été optimisés à l’aide d’un LC Waters 2695 couplé à un TSQ Quantum Ultra de Thermo Fisher et sont répertoriés dans le tableau 3 pour chaque composé.

Temps (min)% A% B
098deux
398deux
1196,43.6
15928
27928
305050
385050
3998deux
4598deux

Table 1. Conditions de gradient HPLC pour la séparation lipidomique en phase normale chirale. Le solvant A est composé à 100 % d’hexanes et le solvant B est le méthanol/isopropanol (1:1).

Paramètre de spectrométrie de masseréglage
sourceL’APCI
modeIon négatif
Longueur de la méthodeDurée : 40 minutes
Largeur de balayage MRM0,002 m/z
Temps de balayage MRM0,15 seconde
Largeur de crête MRM0,70 FWHM
Lentille tube164 V
CID source10 eV
Q2 Gaz de collision1,5 unités
Température du vaporisateur450°C
Température capillaire250°C
Courant de décharge0 μA
Pression de gaz de la gaine25 unités
Pression de balayage ionique3 unités
Pression de gaz auxiliaire5 unités

Table 2. Vous trouverez ci-dessus les paramètres optimisés de spectrométrie de masse pour la mesure des lipides bioactifs. Ces paramètres sont issus d’un Thermo Fisher TSQ Quantum Ultra.

composétransitionCE (eV)RT (min)
13-oxoODE293.03 → 113.10219,9
9-oxoODE293.03 → 113.102117,9
15-oxoETE317.05 → 113.18188.1
13(R)-HODE295.03 → 195.121812,5
13(S)-HODE295.03 → 195.121814,8
[2H4]-13(S)-HODE299.03 → 198.121814,9
9(R)-HODE295.03 → 171.101813,7
9(S)-HODE295.03 → 171.101821,2
[2H4]-9(S)-HODE299.03 → 172.121821,2
20-HETE319.03 → 289.101812.4
[2H6]-20-HETE325.03 → 295.101812.4
5(R)-HETE319.04 → 115.041615,7
5(S)-HETE319.04 → 115.041616.2
[2H8]-5(S)-HETE327.04 → 116.041616,4
12(R)-HETE319.04 → 179.111411.7
12(S)-HETE319.04 → 179.111412.3
[2H8]-12(S)-HETE327.13 → 184.111412,5
15(R)-HETE319.04 → 219.121312.4
15(S)-HETE319.04 → 219.121315,9
[2H8]-15(S)-HETE327.03 → 226.121316.1
11(R)-HETE319.04 → 167.111611.1
11(S)-HETE319.04 → 167.111612,5
8(R)-HETE319.04 → 155.091611.7
8(S)-HETE319.04 → 155.091612,6
LTB4335.03 → 195.101832,0
[2H4]-LTB4339.03 → 197.101832,0
EGP2351.03 → 271.151831,2
[2H4]-EGG2355.03 → 275.151831,2
DPI2351.03 → 271.152532,5
[2H4]-DPI2355.03 → 275.152532,5
8-iso-EGP2351.03 → 271.151837,4
11β-PGF2353.03 → 193.112527,6
[2H4]-11β-PGF2357.03 → 197.112527,6
PGF2α353.03 → 193.112533,1
[2H4]-PGF2α357.03 → 197.112533,1
8-iso-PGF2α353.03 → 193.112534,4
[2H4]-8-iso-PGF 2α357.03 → 197.112534,4

Table 3. Ce tableau répertorie les composés détectés dans les chromatogrammes ioniques totaux de la figure 1A-C. La deuxième colonne fournit la transition utilisée pour MRM/MS, la troisième colonne indique l’énergie de collision (CE, eV) et la dernière colonne répertorie le temps de rétention (RT, min). Les paramètres ont été optimisés à l’aide d’un module de séparation Waters 2695 couplé à un Thermo Fisher TSQ Quantum Ultra.

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les normes et les normes internes utilisées dans ce protocole fournissent une représentation d’une méthode lipidomique ciblée. Un module de séparation Waters 2695 et un Thermo Fisher TSQ Quantum Ultra ont été utilisés pour l’analyse LC-MS et les paramètres optimaux sont disponibles dans les tableaux 1 et 2. De plus, ce protocole d’extraction a été conçu pour les cellules adhérentes, mais peut être modifié pour d’autres types de cellules ainsi que pour d’autres matrices biologiques, notam...

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Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aucun conflit d’intérêts n’a été déclaré.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La plupart des méthodes bioanalytiques actuelles disponibles pour la mesure des lipides bioactifs ne sont pas aussi étendues car elles n’incluent pas la chromatographie chirale en phase normale ou SID. La LC chirale en phase normale est essentielle pour la séparation des énantiomères et pour pouvoir distinguer le métabolisme médié par les enzymes ou les ROS. L’utilisation du SID garantit que l’erreur humaine ou les complications qui surviennent lors de l’extraction ou de l’analyse sont prises en compte lors de la quantification. Ces composants ajoutés, ainsi que l’ECAPCI-MRM, en font la méthode la plus sensible et la plus sélective disponible pour l’analyse des lipides bioactifs.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
5-oxo-6E,8Z,11Z,14Z-eicosatétraénoïque-6,8,9,11,12,14,15-d7 acideCayman Chemical334250[2H7]-5-ox– ;TE Étalon interne
5S-hydroxy-6E,8Z,11Z,14Z-eicosatétraénoïque-5,6,8,9,11,12,14,15-d8 acideCayman Chemical334230[2H8]-5(S)-HETE
12S-hydroxy-5Z,8Z,10E,14Z-eicosatétraénoïque-5,6,8,9,11,12,14,15-d8 acideCayman Chemical334570[2H8]-12(S)-HETE Étalon interne
15S-hydroxy-5Z,8Z,11Z,13E-eicosatetraenoic-5,6,8,9,11,12,14,15-d8 acideCayman Chemical334720[2H8]-15(S)-HETE Étalon interne
20-hydroxy-5Z,8Z,11Z,14Z-eicosatétraénoïque-16,16,17,17,18,18-d6 acideCayman Chemical390030[2H6]-20-HETE Étalon interne
9S-hydroxy-10E,12Z-octadécadiénoïque-9,10,12,13-d4 acideCayman Chemical338410[2H4]-9(S)-HODE Étalon interne
13S-hydroxy-9Z,11E-octadécadienoïque-9,10,12,13-d4 acideCayman Chemical338610[2H4]-13(S)-HODE Étalon interne
9&alpha ;,11&alpha ;,15S-trihydroxy-prosta-5Z,13E-dien-1-oic-17,17,18,19,19,20,20,20-d4 acideCayman Chemical316010[2H4]-PGF2&alpha ; Étalon interne
9&alpha ;,11&alpha ;,15S-trihydroxy-(8β ;)-prosta-5Z,13E-dien-1-oic-3,3,4,4-d4 acideCayman Chemical316350[2H4]-8-iso-PGF2a Étalon interne
9&alpha ;,11β ;.,15S-trihydroxy-prosta-5Z,13E-dien-1-oic-3,3,4,4-d4 acideCayman Chemical10008989[2H4]-11β ;-PGF2 Étalon interne
9&alpha ;,15S-dihydroxy-11-oxo-prosta-5Z,13E-dien-1-oic-17,17,18,18,19,19,20,20,20-d4 acideCayman Chemical312010[2H4]-PGD2 Étalon interne
9-oxo-11&alpha ;,15S-dihydroxy-prosta-5Z,13E-dien-1-oic-17,17,18,18,19,20,20,20,20-d4 acideCayman Chemical314010[2H4]-PGE< sub>2 Étalon interne
5S,12R-dihydroxy-6Z,8E,10E,14Z-eicosatetraenoic-6,7,14,15-d4 acideCayman Chemical320110[2H4]-LTB4 Étalon interne
9&alpha ;,11,15S-trihydroxy-thromba-5Z,13E-dien-1-oic-3,3,4,4-d4 acideCayman Chemical319030[2H4]-TxB2 Étalon interne
5-oxo-6E,8Z,11Z,14Z-eicosatétraénoïque AcideCaïman Chemical342505-ox– ;TE Étalon
12-oxo-5Z,8Z,10E,14Z-eicosatétraénoïque AcideCaïman Chemical3458012-ox– ;TE Étalon
15-oxo-5Z, 8Z,11Z,13E-eicosatétraénoïque AcideCayman Chemical3473015-ox– ;TE Norme
5R-hydroxy-6E,8Z,11Z,14Z-eicosatétraénoïque AcideCayman Chemical342255(R)-HETE Standard
5S-hydroxy-6E,8Z,11Z,14Z-eicosatetraenoïque acidCayman Chemical342305(S)-HETE
Standard 8R-hydroxy-5Z,9E,11Z, Acide 14Z-eicosatétraénoïqueCayman Chemical343508(R)-HETE
Standard 8S-hydroxy-5Z,9E,11Z,14Z-eicosatetraenoicacid Cayman Chemical343608(S)-HETE
Standard 11R-hydroxy-5Z,8Z,12E,14Z-eicosatetraenoic acidCayman Chemical3450511(R)-HETE
Standard 11S-hydroxy-5Z,8Z,12E, Acide 14Z-eicosatétraénoïqueCayman Chemical3451011(S)-HETE
Standard 12R-hydroxy-5Z,8Z,10E,14Z-eicosatetraenoicacid Cayman Chemical3456012(R)-HETE Standard
12S-hydroxy-5Z,8Z,10E,14Z-eicosatetraenoic acidCayman Chemical3457012(S)-HETE Standard
15R-hydroxy-5Z,8Z,11Z, Acide 13E-eicosatétraénoïqueCayman Chemical3471015(R)-HETE Standard
15S-hydroxy-5Z,8Z,11Z,13E-eicosatetraenoicacid Cayman Chemical3472015(S)-HETE
Standard 20-hydroxy-5Z,8Z,11Z,14Z-eicosatetraenoicacid Cayman Chemical9003020-HETE
Standard 9R-hydroxy-10E,12Z-octadecadienoic acidCayman Chemical384059(R)-HODE Norme
9S-hydroxy-10E,12Z-octadécadiénoïque ChemicalCayman Chemical384109(S)-HODE
13R-hydroxy-9Z,11E-acide octadécadiénoïqueCayman Chemical3860513(R)-HODE
Norme 13S-hydroxy-9Z,11E-octadécadiénoïque AcideCayman Chemical3861013(S)-HODE Standard
9&alpha ;,11&alpha ;,15S-trihydroxy-prosta-5Z,13E-dien-1-oicacid Cayman Chemical16010PGF2&alpha ; Standard
9&alpha ;,11&alpha ;,15S-trihydroxy-(8β ;)-prosta-5Z,13E-dien-1-oic acidCayman Chemical163508-iso-PGF2&alpha ; Étalon
9&alpha ;,11β ;,15S-trihydroxy-prosta-5Z,13E-dien-1-acide oïqueCayman Chemical1652011β ;-PGF2 Standard
9&alpha ;,15S-dihydroxy-11-oxo-prosta-5Z,13E-dien-1-oic acidCayman Chemical12010PGD2 Standard
9-oxo-11&alpha ;,15S-dihydroxy-(8β ;)-prosta-5Z,13E-dien-1-oicacid Cayman Chemical143508-iso-PGE2 Standard
9-oxo-11&alpha ;,15S-dihydroxy-prosta-5Z,13E-dien-1-oic acidCayman Chemical14010PGE2 Standard
5S,12R-dihydroxy-6Z,8E,10E,14Z-eicosatetraenoicacid Cayman Chemical20110LTB4 Standard
Acide 9&alpha ;,11,15S-trihydroxythromba-5Z,13E-dien-1-oïqueCayman Chemical19030TxB2 Saline étalon
tamponnée au phosphate GIBCO, par Life Technologies14190
Éther diéthyliqueSigma-Aldrich346136
DichlorométhaneAcros Organics61030-1000anhydre
N,N-diisopropyléthylamineSigma-Aldrich387649
Bromure de pentafluorylbenzyleSigma-Aldrich101052
Hydroxyde de potassiumFluka00650
AcétonitrileFisher ScientificA996-4
MéthanolFisher ScientificA454-4
ChloroformeFisherScientific 366927
HexaneFisher ScientificH303-4
IsopropanolFisher ScientificA464-4
EthanolDecon Laboratories2716
WaterFisher ScientificW7-4
Pasteur PipetsFisher Scientific13-678-200
Tubes à centrifuger en verre de 10 mLKimble Chase73785-10Bouchon à vis
Bouchons à vis phénoliquesKimble Chase73802-13415
Chiralcel ADH ColumnChiral Technologies19325
Flacons HPLCWaters60000751CV
Inserts HPLCWatersWAT094171
Acide chlorhydrique Sigma-Aldrich 320331

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Needleman, P., Turk, J., Jakschik, B. A., Morrison, A. R., Lefkowith, J. B. Arachidonic acid metabolism. Annu. Rev. Biochem. 55, 69-102 (1986).
  2. Nikolaev, V., Reddanna, P., Whelan, J., Hildenbrandt, G., Reddy, C. C. Stereochemical nature of the products of linoleic acid oxidation catalyzed by lipoxygenases from potato and soybean. Biochem. Biophys. Res. Commun. 170, 491-496 (1990).
  3. Panigrahy, D., Kaipainen, A., Greene, E. R., Huang, S. Cytochrome P450-derived eicosanoids: the neglected pathway in cancer. Cancer. Metastasis. Rev. 29, 723-735 (2010).
  4. Basu, S. Bioactive eicosanoids: role of prostaglandin F(2alpha) and F-isoprostanes in inflammation and oxidative stress related pathology. Mol. Cells. 30, 383-391 (2010).
  5. Sanchez-Mejia, R. O., Mucke, L. Phospholipase A2 and arachidonic acid in Alzheimer's disease. Biochim. Biophys. Acta. 1801, 784-790 (2010).
  6. Hersberger, M. Potential role of the lipoxygenase derived lipid mediators in atherosclerosis: leukotrienes, lipoxins and resolvins. Clin. Chem. Lab Med. 48, 1063-1073 (2010).
  7. Allayee, H., Roth, N., Hodis, H. N. Polyunsaturated fatty acids and cardiovascular disease: implications for nutrigenetics. J. Nutrigenet. Nutrigenomics. 2, 140-148 (2009).
  8. Capdevila, J. H., Falck, J. R. Biochemical and molecular properties of the cytochrome P450 arachidonic acid monooxygenases. Prostaglandins Other Lipid Mediat. , 68-69 (2002).
  9. Ciccimaro, E., Blair, I. A. Stable-isotope dilution LC-MS for quantitative biomarker analysis. Bioanalysis. 2, 311-341 (2010).
  10. Blair, I. A. Electron-capture negative-ion chemical ionization mass-spectrometry of lipid mediators. Methods in Enzymology. 187, 13-23 (1990).
  11. Singh, G., Gutierrez, A., Xu, K., Blair, I. A. Liquid chromatography/electron capture atmospheric pressure chemical ionization/mass spectrometry: analysis of pentafluorobenzyl derivatives of biomolecules and drugs in the attomole range. Analytical Chemistry. 72, 3007-3013 (2000).
  12. Blair, I. A. Encyclopedia of Mass Spectrometry. Capriol, R. M., Gross, M. L. , Elsevier. 283-307 (2005).
  13. Lee, S. H., Blair, I. A. Targeted chiral lipidomics analysis by liquid chromatography electron capture atmospheric pressure chemical ionization mass spectrometry (LC-ECAPCI/MS). Methods in Enzymology. 433, 159-174 (2007).

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