Article de méthode

L'extraction des lipides cellulaires pour ciblées dilution isotopique stable analyse de spectrométrie de masse chromatographie liquide-

DOI :

10.3791/3399

⸱

17 novembre 2011

 ,  , 
1Centers for Cancer Pharmacology and Excellence in Environmental Toxicology, University of Pennsylvania , 2Department of Pharmacology, University of Pennsylvania

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ce protocole démontrera l’extraction et l’analyse des acides gras bioactifs libres et estérifiés à partir de cellules. Les acides gras sont quantifiés avec précision à l’aide de la dilution d’isotopes stables, de la chromatographie liquide chirale, de la capture d’électrons, de l’ionisation chimique atmosphérique, de la surveillance de réactions multiples, de la spectrométrie de masse (SID-LC-ECAPCI-MRM/MS).

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le métabolisme des acides gras, tels que l’acide arachidonique (AA) et l’acide linoléique (LA), entraîne la formation de lipides bioactifs oxydés, y compris de nombreux stéréoisomères1,2. Ces métabolites peuvent être formés à partir d’acides gras libres ou estérifiés. Beaucoup de ces métabolites oxydés ont une activité biologique et ont été impliqués dans diverses maladies, notamment les maladies cardiovasculaires et neurodégénératives, l’asthme et le cancer3-7. Les lipides bioactifs oxydés peuvent être formés par voie enzymatique ou par des espèces réactives de l’oxygène (ROS). Les enzymes qui métabolisent les acides gras comprennent la cyclooxygénase (COX), la lipoxygénase (LO) et les cytochromes P450 (CYPs)1,8. Le métabolisme enzymatique entraîne la formation énantiosélective tandis que l’oxydation des ROS entraîne la formation racémique des produits.

Bien que ce protocole se concentre principalement sur l’analyse des métabolites bioactifs dérivés de l’AA et de certains métabolites dérivés de l’AL, il pourrait facilement être appliqué aux métabolites d’autres acides gras. Les lipides bioactifs sont extraits du lysat cellulaire ou des milieux par extraction liquide-liquide (l-l). Au début du processus d’extraction l-l, des étalons internes d’isotopes stables sont ajoutés pour tenir compte des erreurs lors de la préparation de l’échantillon. La dilution des isotopes stables (SID) tient également compte de toutes les différences, telles que la suppression des ions, que les métabolites peuvent rencontrer lors de l’analyse par spectrométrie de masse (MS)9. Après l’extraction, la dérivation avec un réactif de capture d’électrons (EC), le bromure de pentafluorylbenzyle (PFB), est utilisée pour augmenter la sensibilité de détection10,11. La surveillance des réactions multiples (MRM) est utilisée pour augmenter la sélectivité de l’analyse MS. Avant l’analyse MS, les lipides sont séparés à l’aide de la chromatographie liquide à haute performance (HPLC) en phase normale chirale. Les conditions HPLC sont optimisées pour séparer les énantiomères et les différents stéréoisomères des lipidessurveillés 12. Cette méthode spécifique LC-MS surveille les prostaglandines (PG), les isoprostanes (isoP), les acides hydroxyeicosatétraénoïques (HETE), les acides hydroxyoctadécadiénoïques (HODE), les acides oxoeicosatétraénoïques (oxoETE) et les acides oxooctadécadiénoïques (oxoEDE) ; cependant, les paramètres HPLC et MS peuvent être optimisés pour inclure tous les métabolites d’acides gras13.

La plupart des méthodes bioanalytiques actuellement disponibles ne prennent pas en compte la quantification séparée des énantiomères. Ceci est extrêmement important lorsqu’on essaie de déduire si les métabolites ont été formés ou non par des ROS. De plus, les rapports des énantiomères peuvent fournir des preuves d’une voie enzymatique spécifique de formation. L’utilisation de la SID permet une quantification précise des métabolites et tient compte de toute perte d’échantillon pendant la préparation ainsi que des différences rencontrées lors de l’ionisation. L’utilisation du réactif de capture d’électrons PFB augmente la sensibilité de détection de deux ordres de grandeur par rapport aux méthodes APCI conventionnelles. Dans l’ensemble, cette méthode, SID-LC-EC-ionization chimique à pression atmosphérique APCI-MRM/MS, est l’une des méthodes de quantification les plus sensibles, les plus sélectives et les plus précises des lipides bioactifs.

Protocole

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1. Mixages standard et standard internes

  1. Avant l’extraction des lipides, il faut préparer un mélange étalon (SM) et un mélange étalon interne (ISM). Pour le MS, aliquoter le volume équivalent de 1 μg de chaque étalon (25 au total) indiqué dans le tableau des réactifs ci-dessous, à l’aide d’une seringue calibrée, dans une fiole jaugée de 10 mL. Sécher les étalons sous azote et les reconstituer dans 10 mL d’acétonitrile (ACN). La concentration finale du mélange standard sera de 100 pg/μL. Diviser en aliquotes de 1 mL et conserver à -80 °C jusqu’à ce que vous en ayez besoin.
  2. À partir de ce mélange d’étalons, 6 dilutions d’étalons peuvent être effect....

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Discussion

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Les normes et les normes internes utilisées dans ce protocole fournissent une représentation d’une méthode lipidomique ciblée. Un module de séparation Waters 2695 et un Thermo Fisher TSQ Quantum Ultra ont été utilisés pour l’analyse LC-MS et les paramètres optimaux sont disponibles dans les tableaux 1 et 2. De plus, ce protocole d’extraction a été conçu pour les cellules adhérentes, mais peut être modifié pour d’autres types de cellules ainsi que pour d’autres matrices biologiques, notam.......

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Déclarations de divulgation

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Aucun conflit d’intérêts n’a été déclaré.

Remerciements

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La plupart des méthodes bioanalytiques actuelles disponibles pour la mesure des lipides bioactifs ne sont pas aussi étendues car elles n’incluent pas la chromatographie chirale en phase normale ou SID. La LC chirale en phase normale est essentielle pour la séparation des énantiomères et pour pouvoir distinguer le métabolisme médié par les enzymes ou les ROS. L’utilisation du SID garantit que l’erreur humaine ou les complications qui surviennent lors de l’extraction ou de l’analyse sont prises en compte lors de la quantification. Ces composants ajoutés, ainsi que l’ECAPCI-MRM, en font la méthode la plus sensible et la plus sélective disponible pour l’analyse des lipide....

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
5-oxo-6E,8Z,11Z,14Z-eicosatétraénoïque-6,8,9,11,12,14,15-d7 acideCayman Chemical334250[2H7]-5-ox– ;TE Étalon interne
5S-hydroxy-6E,8Z,11Z,14Z-eicosatétraénoïque-5,6,8,9,11,12,14,15-d8 acideCayman Chemical334230[2H8]-5(S)-HETE
12S-hydroxy-5Z,8Z,10E,14Z-eicosatétraénoïque-5,6,8,9,11,12,14,15-d8 acideCayman Chemical334570[2H8]-12(S)-HETE Étalon interne
15S-hydroxy-5Z,8Z,11Z,13E-eicosatetraenoic-5,6,8,9,11,12,14,15-d8 acideCayman Chemical334720[2H8]-15(S)-HETE Étalon interne
20-hydroxy-5Z,8Z,11Z,14Z-eicosatétraénoïque-16,16,17,17,18,18-d6 acideCayman Chemical390030[2H6]-20-HETE Étalon interne
9S-hydroxy-10E,12Z-octadécadiénoïque-9,10,12,13-d4 acideCayman Chemical338410[2H4]-9(S)-HODE Étalon interne
13S-hydroxy-9Z,11E-octadécadienoïque-9,10,12,13-d4 acideCayman Chemical338610[2H4]-13(S)-HODE Étalon interne
9&alpha ;,11&alpha ;,15S-trihydroxy-prosta-5Z,13E-dien-1-oic-17,17,18,19,19,20,20,20-d4 acideCayman Chemical316010[2H4]-PGF2&alpha ; Étalon interne
9&alpha ;,11&alpha ;,15S-trihydroxy-(8β ;)-prosta-5Z,13E-dien-1-oic-3,3,4,4-d4 acideCayman Chemical316350[2H4]-8-iso-PGF2a Étalon interne
9&alpha ;,11β ;.,15S-trihydroxy-prosta-5Z,13E-dien-1-oic-3,3,4,4-d4 acideCayman Chemical10008989[2H4]-11β ;-PGF2 Étalon interne
9&alpha ;,15S-dihydroxy-11-oxo-prosta-5Z,13E-dien-1-oic-17,17,18,18,19,19,20,20,20-d4 acideCayman Chemical312010[2H4]-PGD2 Étalon interne
9-oxo-11&alpha ;,15S-dihydroxy-prosta-5Z,13E-dien-1-oic-17,17,18,18,19,20,20,20,20-d4 acideCayman Chemical314010[2H4]-PGE< sub>2 Étalon interne
5S,12R-dihydroxy-6Z,8E,10E,14Z-eicosatetraenoic-6,7,14,15-d4 acideCayman Chemical320110[2H4]-LTB4 Étalon interne
9&alpha ;,11,15S-trihydroxy-thromba-5Z,13E-dien-1-oic-3,3,4,4-d4 acideCayman Chemical319030[2H4]-TxB2 Étalon interne
5-oxo-6E,8Z,11Z,14Z-eicosatétraénoïque AcideCaïman Chemical342505-ox– ;TE Étalon
12-oxo-5Z,8Z,10E,14Z-eicosatétraénoïque AcideCaïman Chemical3458012-ox– ;TE Étalon
15-oxo-5Z, 8Z,11Z,13E-eicosatétraénoïque AcideCayman Chemical3473015-ox– ;TE Norme
5R-hydroxy-6E,8Z,11Z,14Z-eicosatétraénoïque AcideCayman Chemical342255(R)-HETE Standard
5S-hydroxy-6E,8Z,11Z,14Z-eicosatetraenoïque acidCayman Chemical342305(S)-HETE
Standard 8R-hydroxy-5Z,9E,11Z, Acide 14Z-eicosatétraénoïqueCayman Chemical343508(R)-HETE
Standard 8S-hydroxy-5Z,9E,11Z,14Z-eicosatetraenoicacid Cayman Chemical343608(S)-HETE
Standard 11R-hydroxy-5Z,8Z,12E,14Z-eicosatetraenoic acidCayman Chemical3450511(R)-HETE
Standard 11S-hydroxy-5Z,8Z,12E, Acide 14Z-eicosatétraénoïqueCayman Chemical3451011(S)-HETE
Standard 12R-hydroxy-5Z,8Z,10E,14Z-eicosatetraenoicacid Cayman Chemical3456012(R)-HETE Standard
12S-hydroxy-5Z,8Z,10E,14Z-eicosatetraenoic acidCayman Chemical3457012(S)-HETE Standard
15R-hydroxy-5Z,8Z,11Z, Acide 13E-eicosatétraénoïqueCayman Chemical3471015(R)-HETE Standard
15S-hydroxy-5Z,8Z,11Z,13E-eicosatetraenoicacid Cayman Chemical3472015(S)-HETE
Standard 20-hydroxy-5Z,8Z,11Z,14Z-eicosatetraenoicacid Cayman Chemical9003020-HETE
Standard 9R-hydroxy-10E,12Z-octadecadienoic acidCayman Chemical384059(R)-HODE Norme
9S-hydroxy-10E,12Z-octadécadiénoïque ChemicalCayman Chemical384109(S)-HODE
13R-hydroxy-9Z,11E-acide octadécadiénoïqueCayman Chemical3860513(R)-HODE
Norme 13S-hydroxy-9Z,11E-octadécadiénoïque AcideCayman Chemical3861013(S)-HODE Standard
9&alpha ;,11&alpha ;,15S-trihydroxy-prosta-5Z,13E-dien-1-oicacid Cayman Chemical16010PGF2&alpha ; Standard
9&alpha ;,11&alpha ;,15S-trihydroxy-(8β ;)-prosta-5Z,13E-dien-1-oic acidCayman Chemical163508-iso-PGF2&alpha ; Étalon
9&alpha ;,11β ;,15S-trihydroxy-prosta-5Z,13E-dien-1-acide oïqueCayman Chemical1652011β ;-PGF2 Standard
9&alpha ;,15S-dihydroxy-11-oxo-prosta-5Z,13E-dien-1-oic acidCayman Chemical12010PGD2 Standard
9-oxo-11&alpha ;,15S-dihydroxy-(8β ;)-prosta-5Z,13E-dien-1-oicacid Cayman Chemical143508-iso-PGE2 Standard
9-oxo-11&alpha ;,15S-dihydroxy-prosta-5Z,13E-dien-1-oic acidCayman Chemical14010PGE2 Standard
5S,12R-dihydroxy-6Z,8E,10E,14Z-eicosatetraenoicacid Cayman Chemical20110LTB4 Standard
Acide 9&alpha ;,11,15S-trihydroxythromba-5Z,13E-dien-1-oïqueCayman Chemical19030TxB2 Saline étalon
tamponnée au phosphate GIBCO, par Life Technologies14190
Éther diéthyliqueSigma-Aldrich346136
DichlorométhaneAcros Organics61030-1000anhydre
N,N-diisopropyléthylamineSigma-Aldrich387649
Bromure de pentafluorylbenzyleSigma-Aldrich101052
Hydroxyde de potassiumFluka00650
AcétonitrileFisher ScientificA996-4
MéthanolFisher ScientificA454-4
ChloroformeFisherScientific 366927
HexaneFisher ScientificH303-4
IsopropanolFisher ScientificA464-4
EthanolDecon Laboratories2716
WaterFisher ScientificW7-4
Pasteur PipetsFisher Scientific13-678-200
Tubes à centrifuger en verre de 10 mLKimble Chase73785-10Bouchon à vis
Bouchons à vis phénoliquesKimble Chase73802-13415
Chiralcel ADH ColumnChiral Technologies19325
Flacons HPLCWaters60000751CV
Inserts HPLCWatersWAT094171
Acide chlorhydrique Sigma-Aldrich 320331

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Needleman, P., Turk, J., Jakschik, B. A., Morrison, A. R., Lefkowith, J. B. Arachidonic acid metabolism. Annu. Rev. Biochem. 55, 69-102 (1986).
  2. Nikolaev, V., Reddanna, P., Whelan, J., Hildenbrandt, G., Reddy, C. C. Stereochemical nature of the products....

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Mots-clés

D rivatisation par capture d lectronsHPLC en phase normale chiralesurveillance de r actions multiplesextraction de lipides bioactifsextraction liquide liquidem tabolites de l acide arachidoniquem tabolites de l acide linol iques paration d nantiom res

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