Nous décrivons une méthode relativement simple de transretinal électrorétinogramme (ERG) pour l'obtention des enregistrements photoresponses bâtonnets et des cônes de la rétine de la souris intacte. Cette approche tire profit du bloc de la transmission synaptique de photorécepteurs à isoler leurs réponses claires et de les enregistrer en utilisant des électrodes sur le terrain placé à travers le plat isolé monté sur la rétine.
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Article de méthode
Transretinal Recordings ERG de rétine de souris: Rod et Photoresponses Cône
Dans cet article
Résumé
Résumé
Il ya deux classes distinctes de formation d'image photorécepteurs de la rétine des vertébrés: les bâtonnets et les cônes. Les bâtonnets sont capables de détecter des photons uniques de lumière alors que les cônes fonctionnent en continu dans l'évolution rapide des conditions de forte luminosité. Absorption de la lumière par la canne et de cône spécifiques pigments visuels dans les segments externes des photorécepteurs déclenche une cascade de phototransduction qui mène éventuellement à la fermeture de nucléotides cycliques-dépendants canaux sur la membrane plasmique et une hyperpolarisation cellulaire. Ce changement induit par la lumière dans la membrane actuelle et potentielle peut être enregistré comme une photoréponse, soit par aspiration 1,2 électrode technique classique d'enregistrement ou par des enregistrements électrorétinogramme transretinal (ERG) de rétines isolées avec pharmacologiquement bloqués éléments de réponse post-synaptiques 3-5. Cette dernière méthode permet de drogues accessibles durables enregistrements à partir de photorécepteurs de la souris et est particulièrement utile pour l'obtention photoresponses stables from les cônes de souris maigres et fragiles. Dans le cas de cônes, de telles expériences peuvent être effectuées à la fois dans des conditions adaptés à l'obscurité et qui suit un éclairage intense qui blanchit la quasi-totalité pigment visuel, pour surveiller le processus de récupération de photosensibilité cône pendant adaptation à l'obscurité 6,7. Dans cette vidéo, nous allons montrer comment effectuer tige et M / L-cône axées sur les enregistrements de transretinal adaptés à l'obscurité rétine de souris. Rod enregistrements seront effectués en utilisant des rétines de type sauvage (C57BL / 6) chez la souris. Par souci de simplicité, les enregistrements de cône sera obtenu à partir d'OGM tige transducine α-sous-unité KO (Tα - / -) des souris qui n'ont pas de tige de signalisation 8.
Protocole
1. Fabrication d'électrodes
- Préparer électrodes de verre. Peser 120 mg agar et mélangez dans 10 ml d'eau distillée (concentration finale de 1,2% de gélose). Faire fondre la solution de gélose dans un bain d'eau chaude. Remplir le verre capillaires (nous utilisons des instruments Presision mots TW100-4 capillaires avec les dimensions suivantes: longueur = 100 mm, OD / ID = 1/0.75 mm, et le volume interne = 44 pi) avec la solution de gélose à l'aide seringue en plastique. Solidifier la gélose à la température ambiante pendant 10 min. Ainsi, jusqu'à ~ 200 capillaires peuvent être remplis (le reste du mélange agar peut être conservé à -4 ° C et réutilisés plus....
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Discussion
La méthode de la canne et de cône axées sur les enregistrements ERG transretinal décrit ci-dessus est de devenir un outil puissant pour étudier la fonction des photorécepteurs de la souris à la fois de type sauvage et les animaux génétiquement modifiés. En plus de la caractérisation facile des propriétés photoréponse de base, cette technique simple offre une stabilité excellente réponse au cours de longue durée des expériences effectuées sur les préparatifs rétine proche de l'intactes. Les deux adaptés à l'obscu.......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs ont rien à divulguer.
Remerciements
Soutenu par le Prix de développement de carrière de Research to Prevent Blindness, subventions des NIH EY19312 et EY19543 (VJK), ainsi que par subvention sans restriction de Research to Prevent Blindness et EY02687 (Département d'ophtalmologie et des sciences visuelles à l'Université de Washington).
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires | |
|---|---|---|---|---|
| Nom du produit | Type | Entreprise | Numéro de catalogue | Commenter |
| DL-PA-4 | Biosciences Tocris | 0101 | ||
| Tous les autres réactifs | Sigma-Aldrich | |||
| Verre capillaires | Instruments de précision du monde | TW100-4 | Pour la réalisation d'électrodes | |
| Le papier-filtre | HArg | Millipore | HABG01300 | |
| Photomètre | Instruments UDT | S350 | Pour l'étalonnage de lumière | |
| Capteur en silicium radiométrique | Instruments UDT | 221 | Pour l'étalonnage de lumière | |
| Table anti-vibration | Technique Manufacturing Corporation | TMC 78-239-02R, TMC63-26012-01 | Pour minimiser les bruits mécaniques | |
| Compresseur d'air Panther P 15TC | Werther international | P 15TC | Connecté à table anti-vibration | |
| Stéréomicroscope | LEICA | MZ9.5 | Pour la dissection oeil de la souris | |
| Convertisseurs d'images infrarouges | BEMeyers | ProwlerTM | Lié à stéréomicroscope | |
| Amplificateur différentiel DP-311 | Warner Instruments | DP-311 | ||
| Axon Digidata 1440A Digitizer | ; | Molecular Devices | 1440A | |
| Dual Channel 8-pôles filtre | KROHN-HITE Corporation | 3382 | ||
| Résistance en céramique | TE connectivité | CGS SBCHE618RJ | Pour réchauffer la solution de perfusion | |
| Thermocouple | T | Physitemp Instruments | IT-18 | |
| Contrôleur de température | Oméga | DPi32 | Connecté à thermocouple | |
| LED 505 nm | TT Electronics / Optek Technology | Digi-Key P / N 365-1185-ND | Pour appliquer clignote d'essais et de lumière de blanchiment | |
| Cautère | Bovie | AA25 | Pour marquer la partie dorsaledu globe oculaire souris | |
| pCLAMP 10 électrophysiologie Acquisition de données et le logiciel d'analyse | Molecular Devices |
Références
- Yau, K. W., Lamb, T. D., Baylor, D. A. Light-induced fluctuations in membrane current of single toad rod outer segments. Nature. 269, 78-80 (1977).
- Nikonov, S. S., Kholodenko, R., Lem, J., Pugh, E. N. Physiological features of the S- an....
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Réimpressions et autorisations
