Nous décrivons une méthode relativement simple de transretinal électrorétinogramme (ERG) pour l'obtention des enregistrements photoresponses bâtonnets et des cônes de la rétine de la souris intacte. Cette approche tire profit du bloc de la transmission synaptique de photorécepteurs à isoler leurs réponses claires et de les enregistrer en utilisant des électrodes sur le terrain placé à travers le plat isolé monté sur la rétine.
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Article de méthode
Transretinal Recordings ERG de rétine de souris: Rod et Photoresponses Cône
Dans cet article
Résumé
Résumé
Il ya deux classes distinctes de formation d'image photorécepteurs de la rétine des vertébrés: les bâtonnets et les cônes. Les bâtonnets sont capables de détecter des photons uniques de lumière alors que les cônes fonctionnent en continu dans l'évolution rapide des conditions de forte luminosité. Absorption de la lumière par la canne et de cône spécifiques pigments visuels dans les segments externes des photorécepteurs déclenche une cascade de phototransduction qui mène éventuellement à la fermeture de nucléotides cycliques-dépendants canaux sur la membrane plasmique et une hyperpolarisation cellulaire. Ce changement induit par la lumière dans la membrane actuelle et potentielle peut être enregistré comme une photoréponse, soit par aspiration 1,2 électrode technique classique d'enregistrement ou par des enregistrements électrorétinogramme transretinal (ERG) de rétines isolées avec pharmacologiquement bloqués éléments de réponse post-synaptiques 3-5. Cette dernière méthode permet de drogues accessibles durables enregistrements à partir de photorécepteurs de la souris et est particulièrement utile pour l'obtention photoresponses stables from les cônes de souris maigres et fragiles. Dans le cas de cônes, de telles expériences peuvent être effectuées à la fois dans des conditions adaptés à l'obscurité et qui suit un éclairage intense qui blanchit la quasi-totalité pigment visuel, pour surveiller le processus de récupération de photosensibilité cône pendant adaptation à l'obscurité 6,7. Dans cette vidéo, nous allons montrer comment effectuer tige et M / L-cône axées sur les enregistrements de transretinal adaptés à l'obscurité rétine de souris. Rod enregistrements seront effectués en utilisant des rétines de type sauvage (C57BL / 6) chez la souris. Par souci de simplicité, les enregistrements de cône sera obtenu à partir d'OGM tige transducine α-sous-unité KO (Tα - / -) des souris qui n'ont pas de tige de signalisation 8.
Protocole
1. Fabrication d'électrodes
- Préparer électrodes de verre. Peser 120 mg agar et mélangez dans 10 ml d'eau distillée (concentration finale de 1,2% de gélose). Faire fondre la solution de gélose dans un bain d'eau chaude. Remplir le verre capillaires (nous utilisons des instruments Presision mots TW100-4 capillaires avec les dimensions suivantes: longueur = 100 mm, OD / ID = 1/0.75 mm, et le volume interne = 44 pi) avec la solution de gélose à l'aide seringue en plastique. Solidifier la gélose à la température ambiante pendant 10 min. Ainsi, jusqu'à ~ 200 capillaires peuvent être remplis (le reste du mélange agar peut être conservé à -4 ° C et réutilisés plusieurs fois).
- Couper les capillaires en deux moitiés à l'aide d'un couteau de diamant.
- Faire tremper les électrodes de verre résultant dans une solution d'électrode de la souris pendant au moins 24 heures à 4 ° C. Conserver les électrodes à 4 ° C et les utiliser au cours de la période de 3-4 mois.
2. Configuration du test
- Dark-adapter une souris toute la nuit. Utilisez de type sauvage (par exemple, C57Bl / 6) souris pour tige axées sur les enregistrements transretinal et T alpha - / - tige souris dépourvues de signalisation 8 pour les enregistrements cône transretinal.
- Préparer une solution à 1 perfusion L, 100 ml solution d'électrode, et 20 ml solution d'incubation (voir ci-dessous) et de filtrer le creux solution de perfusion de 0,45 um ou Millipore 0,22 um filtre (en option).
- Calibrer la source de lumière (505 nm LED ou stimulateur ampoule halogène optique) en utilisant un photomètre placé au niveau du plan de la rétine. Dans le cas de source de lumière LED, utilisez un diffuseur optique d'assurer l'uniformité de la lumière.
- Préparer la chambre de perfusion pour l'expérience (constructions de chambre peut varier). Cette enceinte est constituée de 3 mm plexiglas, avec un fond fabriqué à partir du couvercle de boîte de Pétri petite plastique, et a un volume actif de perfusion ~ 400 pi (L = 25 mm, W = 8 mm, H ≈ 2 mm). Remplir l'espace d'électrode inférieure de la chambre avec une solution d'électrode contenant 2 mM de L-glutamate et 10 mM BaCl 2. Utilisation tube en plastique et un capillaire en verre, établir une connexion entre la solution dans l'espace d'électrode inférieure (fait de raccord de tubulure en plastique fixé à la partie inférieure de chambre) et le porte-électrode. Assurez-vous qu'il n'y a pas de bulles dans l'électrode, le tube de raccordement, ou le porte-électrode (purger la solution en utilisant une seringue en plastique si nécessaire).
- Monter la chambre d'enregistrement sur la platine du microscope (facultative: le microscope peut être monté sur une table de antivibratoire et blindé à l'intérieur d'une cage de Faraday pour minimiser le bruit mécanique et électromagnétique). Connecter le porte-électrode inférieure au pôle headstage positive de l'amplificateur différentiel (par exemple Warner Instruments DP-311 amplificateur). Centrer et aligner l'électrode chambre inférieure d'ouverture avec la tache de lumière de relance. Connectez la ligne de perfusion à la chambre d'enregistrement et de tourner la perfusion sur.
- Bubble la solution de perfusion avec 95% de O 2/5% CO 2 tout en incubation à 40 ° C watsalle de bain er. CO 2 ajuste le pH de la solution à 7,2. La solution s'écoule de la bouteille vers la chambre de l'enregistrement par gravité en passant par une résistance en céramique le réchauffant à 36-37 ° C. Afin de réduire les pertes de chaleur, le chauffe-eau doit être situé aussi près de la chambre d'enregistrement que possible, idéalement sur la scène du microscope.
- Avec un régulateur de débit régler le débit d'environ 1 ml / min.
- Connecter l'électrode supérieure à la seconde (négative) du pôle de headstage l'aide d'un second porte-électrodes. Lier la sonde à thermocouple à l'électrode supérieure en utilisant une bague O-. Faire en sorte que les pointes d'électrodes et le thermocouple sont rapprochés de sorte que la lecture de la température est prise au plus près du centre de la rétine que possible. Immerger la pointe de l'électrode supérieure dans la solution de perfusion et le placer dans le centre de la chambre. Laisser 10-15 minutes pour la stabilisation de base.
- Ajuster la tension de courant continu pour l'élément chauffant de sorte que la température de la solution est de 36 -37 ° C.
3. Isoler la rétine de souris
- Sous une lumière rouge sombre, euthanasier la souris adapté à l'obscurité avec le CO 2 et de la dislocation cervicale. Facultatif: faire une marque de référence sur chaque globe oculaire de la souris par cautériser le point le plus dorsale de la sclérotique avec un stylo cautérisation ou broches chauffée dissection. Toutes les procédures subséquentes sont effectuées sous la lumière infrarouge à l'aide de convertisseurs d'images infrarouges ajustement à un microscope à dissection.
- Disséquer les yeux avec des ciseaux courbes en appliquant une pression douce et tendre la peau sur les côtés de chaque œil. Hemisect deux globes oculaires sous un éclairage infrarouge à l'aide microciseaux ou une lame de rasoir.
- Retirez la cornée et le cristallin. Retirez autant du corps vitré que possible.
- Peler la rétine d'abord de la couche de l'épithélium pigmentaire et, si nécessaire, nettoyer en profondeur avec une pince pour enlever granulés restants de l'épithélium pigmentaire. Nous sommes généralement en utilisant des rétines ensemble à la fois pour cônes et des bâtonnets transretenregistrements Inal. Toutefois, si vous souhaitez enregistrer à partir spécifiquement la partie dorsale de la rétine de la souris qui a plus M / L-cônes 9, avant de les peler la rétine enlever la partie ventrale de l'œilleton d'une lame de rasoir ou microciseaux utiliser la marque cautérisation comme une référence.
- Placez le globe oculaire seconde hemisected dans une petite boîte de Petri avec une solution d'incubation et incuber la préparation dans une boîte étanche à la lumière saturée en oxygène pur jusqu'à son utilisation. Généralement, dans ces conditions l'œilleton deuxième souris peuvent être stockés pendant plusieurs heures à température ambiante et utilisé pour les enregistrements.
- L'utilisation d'un verre ou pipette en plastique de transférer la rétine isolée à une goutte de solution de perfusion (environ 300 pi) sur le couvercle d'une boîte de Pétri. Ajouter 5-6 petites gouttes de solution d'électrode contenant BaCl 2 à pré-incuber la rétine avec BaCl 2. Placez un carré (environ 5x5 mm) de la face arrière coin-graissé (nous utilisons Dow Corning lubrifiant pour valve 111 et mastic) Millipore filtre en papier (0,45 um HArg type) avec pré-faites le trou en son centre (2-2,5 mm de diamètre) à la chute de la même solution. Utilisation de la position des pinces de la rétine sur le dessus du papier filtre (côté photorécepteur vers le haut) et appuyez sur ses bords à la périphérie de plate-il monter. La rétine doit être centré sur l'ouverture dans le papier filtre.
- En utilisant des pinces de transférer le papier filtre avec la rétine à la chambre de perfusion et le placer au-dessus du stimulus place aligné espace électrode inférieure. Appuyez légèrement sur les bords graissés du papier filtre pour le lier avec la chambre.
- Placez l'électrode supérieure sur le centre rétine (légèrement toucher la couche des photorécepteurs). Centrage de l'électrode supérieure sur la rétine augmente l'amplitude du signal (% ~ jusqu'à 20-40 par rapport à la plaçant plus près du bord rétine). Bien que l'emplacement, cette électrode déforme légèrement l'intensité de la lumière efficace de stimulation pour atteindre un petit secteur de la rétine (~ 12-15% de sa superficie totale), il est encore le meilleur moyen de placer l 'électiontrode. La préparation est maintenant prêt pour les enregistrements transretinal.
4. Enregistrements Transretinal
- En fonction de votre lignée de souris, record tige ou M / L-cône axées sur les réponses de flash d'essai de faible à l'intensité lumineuse de la lumière calibrée 505 nm à condition de la source lumineuse LED ou stimulateur optique. Dans le cas de notre source de lumière LED, l'intensité du flash est contrôlée par une combinaison de contrôle informatisé de la tension d'entrée LED, résistances commutables, et un ensemble de filtres de densité neutre (nous utilisons E-Colour # 211 0,9 filtres ND de films des Laboratoires Rosco ) placé entre la diode et la rétine. La durée de la LED éclair de test (20 ms) est commandé par un ordinateur. Si en utilisant un stimulateur ampoule halogène optique, l'intensité du flash de test et de longueur d'onde peut être commandé par un ensemble de filtres de densité neutre et étroites filtres d'interférence de bande, respectivement. Test de durée d'éclair peut être contrôlé par ordinateur axées sur les volets.
- Facultatif: pour le maintien de l'efficacitésuppression de la composante gliale de photoréponse avec BaCl 2 tout au long de la journée, de changer la solution électrode inférieure occasionnellement (par exemple, avant l'essai de chaque rétine) en le purgeant à l'aide d'une seringue en plastique rempli avec une solution fraîche.
5. Les résultats représentatifs
Solutions
- Solution pour perfusion souris rétine: 112,5 mM de NaCl, 3,6 mM de KCl, 2,4 mM MgCl 2, 1,2 mM CaCl 2, 10 mM d'HEPES (pH 7,2), 20 mM NaHCO 3, 3 mM Na succinate, 0,5 mM de Na glutamate, 0,02 mM EDTA, et 10 mM de glucose. En outre, la solution est complétée par 2 mM de L-glutamate et 10 uM DL-AP-4 pour bloquer les composants d'ordre supérieur de la photoréponse 10,11, et avec 0,1% MEM MEM vitamines et acides aminés des solutions (Sigma) pour améliorer la rétine la viabilité.
- Solution d'électrode souris: 140 mM de NaCl, 3,6 mM de KCl, 2,4 mM MgCl 2, 1,2 mM CaCl 2, 3 mM HEPES (pH 7,4, NaOH). La solution dans l'élément inférieurespace ctrode contient également 2 mM de L-glutamate de bloquer la transmission synaptique 10 et, en outre, 10 mM de BaCl 2 pour supprimer la composante gliale de la photoréponse 3,12.
- La solution d'incubation Retina: dissoudre 272 mg L-15 (Sigma) et 20 mg de BSA dans 20 ml d'eau déminéralisée. Finale L-15 et les concentrations de BSA sont 13,6 mg / ml et 1 mg / mL, respectivement. Ajuster le pH à 7,4 avec HCl 1 M.
Figure 1. Schéma montrant l'isolement de la rétine de la souris pour les enregistrements ERG transretinal.
Figure 2. Photographie de la chambre de perfusion et des électrodes d'enregistrement avec leurs détenteurs. Les flèches rouges indiquent la direction de débit de perfusion.
Figure 3. Schéma du dispositif expérimental pour les enregistrements ERG transretinal. Les flèches rouges indiquent la direction de débit de perfusion.
Les résultats représentatifs Figure 4:. Enregistré famille de souris tige axées sur les réponses transretinal. Photoresponses étaient filtré passe-bas à 30 Hz (8 pôles de Bessel), numérisé à 1 kHz et stockées sur un ordinateur pour une analyse plus approfondie. Traces affichées représentent les moyennes des réponses à des intensités 5-6 de faible luminosité et 2-3 réponses à des intensités lumineuses saturantes.
Figure 5: Les résultats représentatifs. Famille enregistré de souris cône axées sur les réponses transretinal. Photoresponses étaient filtré passe-bas à 30 Hz (8 pôles de Bessel), numérisé à 1 kHz et stockées sur un ordinateur pour une analyse plus approfondie. Traces affichées sont averages des réponses à des intensités 5-10 de faible luminosité et 3-5 réponses à des intensités lumineuses saturantes.
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Discussion
La méthode de la canne et de cône axées sur les enregistrements ERG transretinal décrit ci-dessus est de devenir un outil puissant pour étudier la fonction des photorécepteurs de la souris à la fois de type sauvage et les animaux génétiquement modifiés. En plus de la caractérisation facile des propriétés photoréponse de base, cette technique simple offre une stabilité excellente réponse au cours de longue durée des expériences effectuées sur les préparatifs rétine proche de l'intactes. Les deux adaptés à l'obscu...
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Déclarations de divulgation
Les auteurs ont rien à divulguer.
Remerciements
Soutenu par le Prix de développement de carrière de Research to Prevent Blindness, subventions des NIH EY19312 et EY19543 (VJK), ainsi que par subvention sans restriction de Research to Prevent Blindness et EY02687 (Département d'ophtalmologie et des sciences visuelles à l'Université de Washington).
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires | |
|---|---|---|---|---|
| Nom du produit | Type | Entreprise | Numéro de catalogue | Commenter |
| DL-PA-4 | Biosciences Tocris | 0101 | ||
| Tous les autres réactifs | Sigma-Aldrich | |||
| Verre capillaires | Instruments de précision du monde | TW100-4 | Pour la réalisation d'électrodes | |
| Le papier-filtre | HArg | Millipore | HABG01300 | |
| Photomètre | Instruments UDT | S350 | Pour l'étalonnage de lumière | |
| Capteur en silicium radiométrique | Instruments UDT | 221 | Pour l'étalonnage de lumière | |
| Table anti-vibration | Technique Manufacturing Corporation | TMC 78-239-02R, TMC63-26012-01 | Pour minimiser les bruits mécaniques | |
| Compresseur d'air Panther P 15TC | Werther international | P 15TC | Connecté à table anti-vibration | |
| Stéréomicroscope | LEICA | MZ9.5 | Pour la dissection oeil de la souris | |
| Convertisseurs d'images infrarouges | BEMeyers | ProwlerTM | Lié à stéréomicroscope | |
| Amplificateur différentiel DP-311 | Warner Instruments | DP-311 | ||
| Axon Digidata 1440A Digitizer | ; | Molecular Devices | 1440A | |
| Dual Channel 8-pôles filtre | KROHN-HITE Corporation | 3382 | ||
| Résistance en céramique | TE connectivité | CGS SBCHE618RJ | Pour réchauffer la solution de perfusion | |
| Thermocouple | T | Physitemp Instruments | IT-18 | |
| Contrôleur de température | Oméga | DPi32 | Connecté à thermocouple | |
| LED 505 nm | TT Electronics / Optek Technology | Digi-Key P / N 365-1185-ND | Pour appliquer clignote d'essais et de lumière de blanchiment | |
| Cautère | Bovie | AA25 | Pour marquer la partie dorsaledu globe oculaire souris | |
| pCLAMP 10 électrophysiologie Acquisition de données et le logiciel d'analyse | Molecular Devices |
Références
- Yau, K. W., Lamb, T. D., Baylor, D. A. Light-induced fluctuations in membrane current of single toad rod outer segments. Nature. 269, 78-80 (1977).
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- Frank, R. N., Dowling, J. E. Rhodopsin photoproducts: effects on electroretinogram sensitivity in isolated perfused rat retina. Science. 161, 487-489 (1968).
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Réimpressions et autorisations
