Quantitatives de fluorescence Live Cell-microscopie Analyse de la levure à fission

Résumé

La levure de fission, Schizosaccharomyces pombe, Est un bon modèle pour étudier les processus cellulaires de base. Nous décrivons ici une méthode pour effectuer l'analyse quantitative des cellules vivantes de levure à fission. Dans cette expérience particulière nous nous concentrons sur l'organisation du génome dans le noyau cellulaire, mais la méthode peut également être utilisé pour étudier les facteurs cytosoliques.

Résumé

Plusieurs techniques de microscopie sont aujourd'hui disponibles qui permettent de détecter une protéine spécifique dans la cellule. Durant la dernière décennie imagerie des cellules vivantes en utilisant des fluorochromes comme la Green Fluorescent Protein (GFP) directement attaché à la protéine d'intérêt est devenu plus populaire ^1. En utilisant la GFP et fluorochromes similaires les localisations subcellulaires et les mouvements des protéines peuvent être détectées dans un microscope à fluorescence. Par ailleurs, outre la localisation subnucléaires d'une certaine région d'un chromosome peut être étudiée en utilisant cette technique. GFP est fusionnée à la protéine répresseur lac (LACR) et ectopique exprimé dans la cellule où les répétitions en tandem de la séquence lacO a été inséré dans la région d'intérêt sur ​​le chromosome ^2. Le LACR-GFP va se lier à des répétitions lacO et cette région du génome sera visible comme un point vert dans le microscope à fluorescence. La levure est particulièrement adapté pour ce type de manipulation depuis homologuesrecombinaison est très efficace et permet ainsi une intégration ciblée des répétitions lacO et protéines de fusion avec la GFP conçu ^3. Nous décrivons ici une méthode quantitative pour l'analyse de cellules vivantes de levure à fission. Des protocoles additionnels pour l'analyse de cellules vivantes de levure à fission peut être trouvé, par exemple sur la façon de faire un film sur les ⁴ comportements chromosomique méiotique. Dans cette expérience particulière, nous nous concentrons sur l'organisation subnucléaire et comment elle est affectée lors de l'induction de gènes. Nous avons marqué un cluster de gènes, nommés Chr1, par l'introduction de sites lacO obligatoire dans le voisinage des gènes. Le groupe de gènes est enrichie par des gènes qui sont induits par la famine au début lors de l'azote de ⁵ levure à fission. Dans la souche de la membrane nucléaire (NM) est étiqueté par l'attachement de la mCherry Cut11 protéines NM donnant lieu à un signal rouge fluorescent. Le pôle du corps de la broche (SPB) composé SID4 est fusionnée à la protéine fluorescente rouge (SID4-MRFP) ⁶ 7. Le SPB est identifié comme une grande structure ronde au NM. En imagerie avant et 20 minutes après l'épuisement de la source d'azote, nous pouvons déterminer la distance entre le groupe de gènes (GFP) et le NM / SPB. Les distances moyennes ou médianes avant et après épuisement de l'azote sont comparés et nous pouvons ainsi mesurer si oui ou non il ya un décalage dans la localisation subcellulaire de la grappe gène après épuisement de l'azote.

Protocole

1. Culture de levure de fission

1. Préparer Edinburgh Minimal Médias (EMM) et EMM, sans chlorure d'ammonium (EMM-N) ^8. Afin de réduire l'autofluorescence de la solution de glucose ne doit pas être autoclavés, mais plutôt en utilisant un filtre stérilisé filtre de 0,2 um et ensuite ajouté à la presse en autoclave.
2. Inoculer les cellules de levure à fission fraîchement cultivés sur une plaque de gélose avec les médias riches, PJE ^8, dans 3 ml de liquide avec les médias EMM de glucose stérilisé filtre. Utilisez des tubes 13ml avec une légère poussée sur le couvercle pour assurer une bonne ventilation des cellules. Laissez les cellules se développent en les secouant avec 225 rpm à 30 ° C. Gardez la croissance des cellules en phase log (1 x 10 ⁶ - 2 x 10 ⁷ cellules / ml) pendant 2 jours en les comptant à l'aide d'une chambre Burker suivie par dilution appropriée, chaque matin et chaque soir.
3. Le jour de l'expérience assurez vous d'avoir des cellules en phase logarithmique précoce, 5 x 10 ⁶ - 1 X 10 ⁷ cellules / ml.
4. Pour mourir de faim tIl cellules de l'azote pendant 20 minutes à partir de supports switch EMM EMM-N médias. Cela se fait par prélèvement de 3 ml de cellules dans un tube Eppendorf de 1,5 ml dans une centrifugeuse de paillasse au maximum 1,5 fcr que centrifugation à une vitesse plus rapide pourrait provoquer une réaction de stress dans ⁹ levure à fission. Utilisez la technique du double de filature, de sens; premier spin pendant 2 min, puis tournez le tube Eppendorf de 180 ° et faites tourner à nouveau pour 1,5 rcf 2 min ^10. Cela permet de rassembler toutes les cellules dans une pastille au fond du tube. Laver une fois avec EMM-N et ensuite dissoudre le culot dans EMM-N et incuber les cellules pendant 15 minutes à 30 ° C en agitant à 225 rpm, puis continuer au point 2. La préparation des échantillons.

2. La préparation des échantillons

1. Récolte de 1,5 mL de cellules dans un tube Eppendorf de 1,5 ml dans une centrifugeuse de paillasse au maximum 1,5 fcr que centrifugation à une vitesse plus rapide pourrait provoquer une réaction de stress dans ⁹ levure à fission. Utilisez la technique du double filature, meaning; premier spin pendant 2 min, puis tournez le tube Eppendorf de 180 ° et faites tourner à nouveau pour 1,5 rcf pendant 2 min ^10. Cela permet de rassembler toutes les cellules dans une pastille au fond du tube.
2. Retirer le surnageant, mais laisser 10 à 15 uL et remettre en suspension les cellules dans les médias reste. Alternativement ajouter 10 ul de milieux frais pour remettre le culot cellulaire.
3. Assurez-vous d'avoir des lames de verre clair et couvercle en verre (pas 1.5). Normalement, vous n'avez pas à les nettoyer, mais assurez-vous qu'ils ne sont pas pleins de poussière.
4. Sortez du congélateur une aliquote d'une solution stock de lectine 1mg/mL qui a été stérilisée par filtration. La solution de lectine peuvent être recongelés plusieurs fois. La lectine est utilisé pour fixer les cellules de levure au couvercle en verre.
5. Placez 5 pi de EMM de glucose stérilisé filtre sur le verre objectif.
6. Placez 5 pi de solution de lectine dans le coin de la vitre de couverture. Par la suite placer 5 uL de culture de cellules dans le même coin, c'est à dire dans la chute de la lectine. Mélanger à la pipette quelques fois et puis étaler la culture cellulaire lectine mélange à travers le couvercle en verre en utilisant le côté long de la pointe de la pipette. Selon la densité de votre mélange de cellules ou de tout laisser aspirer l'excès de liquide dans le coin opposé du verre de couverture.
7. Placez le couvercle en verre, en haut, avec un côté sur le verre objectif et de l'autre côté sur le banc. Laissez le couvercle en verre sécher un peu pendant quelques minutes. Il doit absolument pas être complètement sec, mais il ne faut pas trop de liquide sur le verre.
8. Placez le couvercle en verre avec un ange d'environ 70 ° par rapport au verre objectif par la chute d'EMM. Lâchez le couvercle en verre afin qu'il va tomber de haut en bas dans la goutte d'EMM.
9. Pour sceller les bords avec de la graisse silicone préparer une seringue de 2 ml. Couper l'extrémité large de la pointe 200 pi et le joindre à la seringue. Remplir la seringue avec environ 1 ml de graisse au silicone. Une ligne fine de silicium est appliqué sur les bords du verre couvercle en douceur du pushing le piston de la seringue. Maintenant vous avez une petite chambre de croissance de S. cellules pombe.

3. Microscopie

1. Initialiser le microscope à fluorescence en allumant la lampe au mercure / xénon, le microscope et l'ordinateur. Placer la chambre de croissance de la levure dans le microscope à fluorescence. Utilisez un objectif 63 X ou un objectif 100 X avec NA = 1.3 ou supérieur. Si un objectif de pétrole est utilisé, ajouter l'huile.
2. Utilisez le champ clair de trouver les cellules et obtenir une image nette.
3. Les réglages pour la microscopie par fluorescence varient selon les fluorochromes utilisés pour marquer les cellules de levure et le microscope. Nous utilisons un microscope confocal Zeiss LSM 700 microscope laser à balayage avec le Plan-Apochromat lentilles huile d'objectif 63x (NA = 1,4) avec la ligne de réglage 16 plan de balayage moyenne. Le sténopé doit être réglé de 1 à 1,1 unités d'Airy, qui donne une tranche optique de 0,8 mm. Nous détectons la GFP dans la piste 1 en utilisant le jeu de filtres pour Alexa 488 avec un séparateur de faisceau à 582 nm, donc detecting longueurs d'onde entre 488 et 582 nm. En piste 2, nous utilisons un ensemble de filtres optimaux pour mCherry utilisant un séparateur de faisceau à 578 nm, donc la détection des longueurs d'onde entre 578 et 600 nm. Cela signifie que la piste 2 fois le rapport de la direction (SPB) et NM (mCherry) sera détectée.
4. Prenez autant de photos nécessaires pour être capable de mesurer dans 60 cellules différentes pour chaque souche. Habituellement 15 photos de champs de microscopie indépendants sont assez. Il est recommandé une chambre de croissance de nouvelles cellules fraîches avec est faite, si votre temps de microscopie dépasse 60 minutes.

4. La mesure quantitative des distances subcellulaire

1. Ouvrez les photos dans le programme d'édition Zeiss Lumière zen. En utilisant la mesure de l'outil de mesures de la distance en um entre les différents fluorochromes dans toutes les cellules où tous les signaux sont dans le même plan focal. Ajuster l'intensité lumineuse et le contraste pour identifier le centre du signal fluorescent. Ce protocole simplifié n'utilise que deux c différentesouleurs et donc le SPB et NM sont dans le même canal. Le SPB est distingué par sa structure dans le grand rond NM. Transfert des distances à une feuille de bloc-notes. Mesurer au moins 60 cellules. D'autres programmes tels que ImageJ pourrait également être utilisé pour mesurer la distance, mais Zeiss zen Lumière est préférée en raison de sa plus haute résolution de l'image et la facilité d'zoomer et dézoomer à l'aide de ce programme. Photos en format LSM a ouvert en ImageJ aura les deux canaux sur le dessus de l'autre. Pour faire une photo avec les deux canaux, d'abord séparer les deux canaux et par la suite les fusionner. Par la suite, l'outil en ligne peut être utilisé pour mesurer les distances tel que décrit ci-dessus.
2. Comparez les distances moyennes ou médianes subcellulaire entre différentes souches et les traitements en utilisant un programme statistique, par exemple t-test ou test de Mann-Whitney somme des rangs, par exemple en utilisant le logiciel SigmaStat-3.5. Fréquemment, les données ne sont pas normalement distribuées, depuis il y aura une sélection des cellules avec des courtsdistances entre les signaux fluorescents puisque tous les signaux doivent être dans le même plan focal à mesurer. Un t-test ne peut être utilisé lorsque les données ont une distribution normale alors qu'un test de Mann-Whitney permet la comparaison des ensembles de données qui n'ont pas une distribution normale. Dans un test t de la moyenne des deux ensembles de données différents sont comparés alors que dans un test de Mann-Whitney, la médiane est comparée.

5. Les résultats représentatifs

Strain PJ1185: (H ^{+ +} his7:: dis1placR - GFP Chr1 [:: ura4 ⁺ hphMX6 lacO] SID4-MRFP:: kanMX6 cut11-mCherry:: natMX6 ura4-D18-32 leu1 ade6-DN / N) a été cultivé dans EMM . Un échantillon a été retiré et monté dans une chambre de croissance des petites et photos ont été prises (fig. 1A + N). Par la suite le milieu de croissance a été remplacé par EMM w / o chlorure d'ammonium (EMM-N), et les cellules sont grown pendant 15 minutes en secouant. Les cellules ont ensuite été affamés d'azote monté dans une chambre de croissance avec EMM-N et photos ont été prises (fig. 1A-N). L'outil de mesure a été utilisée pour mesurer la distance entre le lieu (GFP) et le SPB (Fig. 1B et tableau 1). En outre, la distance entre le locus (GFP) et le NM a été mesurée (Fig. 1B et tableau 2). Les distances médianes subcellulaire avant et après épuisement de l'azote ont été comparées en utilisant le logiciel de SigmaStat-3.5 (tableau 3). Il y avait un décalage statistiquement significatif dans la localisation de l'amas de gènes s'éloignant de la NM vers la SBP. Les données mesurant la distance entre la GFP et la SBP a une distribution normale, et donc les distances moyennes (1,777 um + N et 1587 um-N) peut être comparé en utilisant un test t (Tableau 1 et 3). Il y avait une différence significative entre les deux valeurs moyennes (p = 0,008, test t). Les données mesurant la distance entre la GFP et NM n'ont pas eu une normale distribution et donc les distances médianes (0 um + N et 0,390 um-N) ont été comparés en utilisant un test de Mann-Whitney (tableau 2 et 3). Il y avait une différence significative entre les deux valeurs médianes (P <0,001, test de Mann-Whitney somme des rangs).

Figure 1. La localisation d'un cluster de gènes nommés Chr1, marquée par la GFP, a changé après la famine azote. (A) Colonne de gauche, + N, un noyau de cellule représentant une cellule cultivée dans la colonne de droite EMM-N, un noyau de cellule représentant une cellule cultivée dans EMM-N. Le vert est le signal GFP étiquetage du cluster Chr1, le rouge est la RDRF et de l'étiquetage mCherry le SPB et NM, respectivement. (B) le noyau même cellule que (A) mais maintenant, avec les distances mesurées subnucléaires; jaune: le diamètre du noyau cellulaire, bleu: la distance entre les SPB et GFP signal et rose: la distance entre le signal GFP et la membrane nucléaire.

Tableau 1. Les distances mesurées subnucléaires en um de la souche cultivée dans PJ1185 EMM. Première rangée, diamètre de la cellule (d), deuxième rangée, la distance entre la GFP et le SPB, la troisième rangée, la distance entre la GFP et la NM.

Tableau 2. Les distances mesurées subnucléaires en um de la souche cultivée dans PJ1185 EMM-N. Première rangée, diamètre de la cellule (d), deuxième rangée, la distance entre la GFP et le SPB, la troisième rangée, la distance entre la GFP et la NM.

Tableau 3. Statistiques descriptives des distances observées dans la souche subnucléaires PJ1185 avant (+ N) et après (-N) de famine azote. Première rangée: le nombre de cellules mesurées, deuxième rangée: diamètre moyen (d), troisième ligne: diamètre médian (d), ci-ligne: la distance moyenne entre la GFP et SPB, cinquième ligne: les distances médianes entre la GFP et NM.

Discussion

Durant la dernière décennie l'utilisation de l'imagerie de cellules vivantes pour surveiller les événements cellulaires est devenu plus populaire. Cela a commencé avec l'utilisation de la protéine à fluorescence verte de la méduse Aequorea victoria et maintenant de nombreux fluorochromes différents sont disponibles à travers une émission de fluorescence large spectre de cyan (475 nm) à rouge lointain (648 nm) ^11. Un des principaux avantages de l'imagerie des cellules vivantes au cours d'immunofluorescence est que les cellules ne sont pas fixés par le formaldéhyde ou de l'éthanol / acétone traitement avant la microscopie, évitant ainsi les artefacts possibles du processus de fixation. En outre, imagerie des cellules vivantes offre la possibilité de suivre des cellules individuelles et de prendre des photos à intervalles fréquents pendant les heures ou les jours d'incubation, ce qui permet d'obtenir des films d'événements cellulaires ^12. Les cellules de mammifères ont l'avantage d'avoir une plus grande taille, avec des diamètres de l'ordre de 100 pm, par rapport à la cellule plus petite levure avec un diamètre d'environ 3-4 μ m. D'autre part, l'avantage avec de la levure est le génome facilement manipulable. La recombinaison homologue se produit très efficace dans la levure et est utilisée pour fusionner des protéines d'intérêt à des fluorochromes différents ^3. Par ailleurs, en utilisant l'intégration ciblée de séquences et d'expression lacO ultérieure de LACR-protéine GFP permet la détection d'une partie spécifique du génome dans le noyau cellulaire ^2. Utiliser S. pombe cellules en microscopie a des avantages supplémentaires car ils sont naturels des organismes unicellulaires qui se développent avec un temps de génération rapide à faible coût conditions de culture cellulaire. En outre, S. pombe est un organisme eucaryote excellent modèle car il a des gènes homologues métazoaires.

Une des principales limites de cette technique est autofluorescence dans la cellule de levure perturber la détection du signal vrai. Ce problème peut être surmonté en utilisant des milieux de croissance minimale de glucose stérilisé filtre au lieu de l'autoclave. DansOutre les cellules de levure doivent être cultivées pendant 2 jours en phase journal avant leur montage. Le protocole présenté ici propose une méthode relativement simple, mais pourtant quantitatives pour déterminer la localisation subcellulaire des protéines dans la cellule de levure. D'ailleurs en prenant des photos à différents moments, nous pouvons suivre les événements cellulaires.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Nom de réactif / équipements	Société	Numéro de catalogue	Commentaire
Lectine	Sigma	L1395
Graisse silicone	Dow Corning
Microscope à balayage laser LSM 700	Zeiss	LSM 700	Autres microscope confocal pourraient être utilisés.
SigmaStat 3.5	Statcon	SigmaStat 3.5	N'importe quel logiciel d'analyse statistique pourrait être utilisé.