γ-herpèsvirus (γ-HVS) établir long de la vie la persistance dans leur hôte. L'infection de souris avec γ-HV68 offre une tractable génétiquement In vivo Modèle pour la caractérisation du cycle de vie / pathogenèse de γHVs. Ce protocole décrit la détection et la quantification de l'infection au γHV68 phases aiguës et latentes après l'infection par le formant plage, centre infectieuses, et des essais qPCR.
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Article de méthode
Mesure de γHV68 infection chez les souris
Dans cet article
Résumé
Résumé
γ-herpèsvirus (γ-VH) sont remarquables par leur capacité à établir des infections latentes de cellules lymphoïdes 1. La gamme d'hôtes étroite humaine γ-HVS, comme l'EBV et KSHV, a gravement entravé les études détaillées pathogènes. Murin γ-herpèsvirus 68 (γHV68) part importante des similitudes génétiques et biologiques avec les humains et les γ-HVS est un agent pathogène naturel des rongeurs muridés 2. En tant que tel, l'évaluation des γHV68 infection de la souris des souches consanguines à différents stades de l'infection virale constitue un modèle important pour la compréhension du cycle de vie virale et la pathogénèse au cours γ-HVS infection.
Après inoculation intranasale, γHV68 résultats d'infection aiguë de la virémie dans les poumons qui est ensuite résolue en une infection latente des splénocytes et des autres cellules, qui peuvent être réactivées pendant toute la durée de l'hôte 3,4. Dans ce protocole, nous allons décrire la façon d'utiliser le dosage de la plaque d'ânestitre s de virus infectieux dans les poumons homogénats sur des monocouches de cellules Vero à un stade précoce (5 - 7 jours) de la post-infection intranasale (ppp). Alors que l'infection aiguë est largement effacé 2-3 après l'infection semaines, une infection latente de γHV68 est établi autour de 14 dpi et maintenue plus tard dans la rate des souris. L'infection latente affecte généralement une très petite population de cellules dans les tissus infectés, par lequel le virus reste dormant et s'éteint la plupart de son expression génique. Splénocytes latente infectée par le virus spontanément réactiver après explantation dans la culture tissulaire, qui peut être récapitulée par un centre infectieuses (IC) d'essai pour déterminer la charge virale latente. Afin d'estimer la quantité de copies du génome viral dans le aiguë et / ou des tissus infectés latents, quantitatifs PCR en temps réel (qPCR) est utilisé pour sa sensibilité maximale et précision. Les analyses combinées des résultats de dosage de qPCR et de la plaque, et / ou le dosage IC va révéler les profils spatio-temporelle des virusla réplication et l'infectiosité in vivo.
Protocole
Le protocole suivant décrira l'étude de titres de virus et les charges du génome viral dans le cycle d'infection lytique et latente des γHV68 chez la souris, qui peuvent théoriquement être utilisés pour évaluer l'infection par d'autres virus de partage de mode de vie semblable à celle de γHV68.
1. Amplification du γHV68
- Dégeler une ampoule congelée d'γHV68 de 37 ° C l'eau de bain.
- Ajouter inoculums viraux pour NIH3T12 ou la culture de cellules 3T3 (~ 50% de confluence) en boîtes de 10 cm et la culture des cellules infectées à 37 ° C dans 5% de CO 2.
- Examiner la culture par microscopie pour effet c....
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Discussion
γHV68 a été largement utilisé comme un modèle pour comprendre la pathogenèse de l'humain γ-HVS 2,4,5. Dans ce protocole, nous avons décrit trois méthodes couramment utilisées, y compris essai de plaque pour titre viral infectieux, test de circuits intégrés pour la charge virale latente, et qPCR pour la charge du génome viral, pour évaluer l'infection aiguë et latente de γHV68 après inoculation intranasale chez des souris.
Le dosage de la plaque a été largement utilisée pou.......
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Déclarations de divulgation
Pas de conflits d'intérêt déclarés.
Remerciements
Les auteurs tiennent à remercier les conseils techniques et le soutien de Ren Soleil (University of California, Los Angeles) et Seungmin Hwang (université de Washington). Ce travail a été financé par la Fondation Baxter, National Institutes of Health subventions (R01 et R21 CA140964 AI083841 à C. Liang).
....Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Nom du produit | Procédure de préparation | ||
| Moyennes Méthylcellulose overlay (MC) pour le dosage de la plaque virale |
| ||
| Fix / teinture moyenne pour le dosage de la plaque | 0,2% (p / v) de violet cristallisé dans l'éthanol 20%. | ||
| Lysis Buffer ACK | NH 4 Cl 0,15, KHCO3 10 mM, 0,1 mM EDTA | ||
| DMEM complet | Eagle modifié par Dulbecco à moyen(DMEM) supplémenté avec 10% de sérum de veau fœtal (FBS; Invitrogen), 2 mM de L-glutamine et 1% de pénicilline-streptomycine (Gibco-BRL). |
Les médias le tableau 1. Spécifiques utilisés dans ce protocole
| Nom du réactif | Société | Numéro de catalogue |
|---|---|---|
| La kétamine | Sigma-Aldrich | K2753 |
| Xylazine | Sigma-Aldrich | X1251 |
| Méthylcellulose | Sigma-Aldrich | M0512-250g |
| 2 x MEM | Life Technologies | 11935 |
| Tamis cellulaire | BD Faclon | 352340 |
| Omni tissus homogénéisateur | Omni International | TH115 |
| Sang DNeasy Tissue Kit & | QiaGen | 69504 |
| iQTM SYBRH vert Supermix | BioRad | 170-8882 |
| CFX96 système en temps réel de PCR | Bio-Rad | 184-5072 |
| Compteur de cellules | Bio-Rad | 145-0001 |
| Sorvall SA-600 | Thermo Scientific | 096-124022 |
Tableau 2. Réactifs et équipements spécifiques
Références
- Damania, B., Choi, J. K., Jung, J. U. Signaling activities of gammaherpesvirus membrane proteins. J. Virol. 74, 1593-1601 (2000).
- Stevenson, P. G., Efstathiou, S. Immune mechanisms in murine gammaherpesvirus-68 infection. Viral. Immunol. 18, 445-456 (2005).
- Flano, ....
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Réimpressions et autorisations
