Article de méthode

Détection des interactions des protéines dans les plantes en utilisant une passerelle de complémentation par fluorescence bimoléculaire Compatible (BiFC) Système

DOI :

10.3791/3473

16 septembre 2011

Dans cet article

Résumé

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Nous avons développé une technique pour tester les interactions entre protéines dans les plantes. Une protéine fluorescente jaune (YFP) est divisée en deux fragments non-cumul. Chaque fragment est clone dans leur cadre d'un gène d'intérêt par l'intermédiaire du système de passerelle, permettant l'expression de protéines de fusion. Reconstitution du signal YFP ne survient que lorsque les protéines interagissent l'enquête.

Résumé

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Nous avons développé une technique BiFC pour tester l'interaction entre deux protéines in vivo. Ceci est accompli par fractionnement d'une protéine fluorescente jaune (YFP) en deux fragments non-cumul. Chaque fragment est clone dans leur cadre d'un gène d'intérêt. Ces constructions peuvent alors être co-transformé en Nicotiana benthamiana par transformation Agrobacterium, permettant l'expression de protéines de fusion de transit. La reconstitution du signal YFP ne survient que lorsque les protéines interagissent l'enquête 1-7. Pour tester et valider les interactions protéine-protéine, BiFC peut être utilisé avec deux hybrides de levure (Y2H) dosage. Ceci peut détecter les interactions indirectes qui peuvent être négligés dans le Y2H. La technologie Gateway est une plate-forme universelle qui permet aux chercheurs de faire la navette le gène d'intérêt (GOI) en tant qu'expression de nombreux systèmes et l'analyse fonctionnelle que 8,9 possible. Tant l'orientation et de cadre de lecture peut être maintenue sans l'aide d'enzymes de restriction ou la ligature de rendre l'expression prêts clones. En conséquence, on peut éliminer toutes les étapes de re-séquençage à assurer des résultats constants au cours des expériences. Nous avons créé une série de vecteurs et de la passerelle BiFC Y2H compatibles qui permettent aux chercheurs facile à utiliser des outils pour effectuer des essais et des deux BiFC Y2H 10. Ici, nous démontrons la facilité d'utilisation de notre système BiFC de tester les interactions entre protéines dans N. benthamiana.

Protocole

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1. Préparation de la culture d'Agrobacterium

  1. Souche d'Agrobacterium GV3101 préalablement transformées avec Gateway compatibles BiFC vecteur pEarleyGate201-YC et pEarleyGate202-YN, contenant chacune une construction de fusion de l'IGE.
  2. Inoculer un 5-ml YEB (5g L Extrait de bœuf -1, 1g L extrait de levure -1, 5g L -1 peptonée, 5g L -1 de saccharose, 2 mM MgSO 4, pH 7,2) culture de la protéine de fusion BiFC construit transformée par Agrobacterium avec la sélection appropriée des antibiotiques. Cultivez la culture nuit à 28 ° C en agitant à 200 rpm.
  3. Retirer 1....

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Discussion

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Test BiFC est un outil puissant pour étudier les interactions entre protéines. Contrairement à l'analyse traditionnelle Y2H, BiFC non seulement permet la visualisation des interactions protéine-protéine, mais fournit également plus d'informations sur le complexe protéique, comme localisation sub-cellulaire. En outre, il est possible de détecter des interactions indirectes tant que les deux protéines candidat peut être amené suffisamment près par un troisième partenaire. Comme toute technologie, BiFC a ses limite.......

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Déclarations de divulgation

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Aucun conflit d'intérêt déclaré.

Remerciements

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Nous remercions Vi Nguyen pour la lecture du manuscrit et de l'assistance du laboratoire général.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
AcétosyringoneSigma-AldrichD134406
MES hydrateSigma-AldrichM2933
1 mL seringue à tuberculine à embout glissantBD Biosciences309602

Références

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  1. Ohad, N., Yalovsky, S. Utilizing bimolecular fluorescence complementation (BiFC) to assay protein-protein interaction in plants. Methods in molecular biology. 655, 347-358 (2010).
  2. Fang, Y., Spector, D. L. BiFC imaging as....

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Mots-clés

Protein InteractionBimolecular Fluorescence ComplementationGateway CompatibleAgrobacterium Mediated TransformationNicotiana BenthamianaYeast Two HybridConfocal MicroscopyCo ImmunoprecipitationFluorescent Protein ReconstructionPlant Expression System

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