Préparation des tissus et des fibres Immunocoloration souris nerveuses sensitives innervant la peau et les os du membre

Résumé

L'identification immunocytochimique de sensitive périphérique sous-types de fibres nerveuses (et de détection de l'expression des protéines qui y sont) sont essentiels à la compréhension des mécanismes moléculaires sous-jacents sensations périphériques. Nous décrivons ici les méthodes de préparation d'échantillons de tissus périphériques / viscérale, tels que les os de la peau et des membres, par immunomarquage spécifique des fibres nerveuses périphériques sensorielles.

Résumé

Détection et traitement primaire des propriétés physiques, chimiques et thermiques par des stimuli sensoriels périphériques fibres nerveuses sensorielles est la clé de la perception sensorielle chez les animaux et les humains. Ces fibres nerveuses sensitives périphériques expriment une multitude de récepteurs et de protéines des canaux ioniques qui détectent et initier des stimuli sensoriels spécifiques. Les méthodes sont disponibles pour caractériser les propriétés électriques des fibres nerveuses sensorielles périphériques innervant la peau, qui peut également être utilisé pour identifier l'expression fonctionnelle des protéines des canaux ioniques spécifiques dans ces fibres. Toutefois, les méthodes électrophysiologiques similaires ne sont pas disponibles (et sont également difficiles à développer) pour la détection de l'expression fonctionnelle des récepteurs et des protéines des canaux ioniques dans les fibres nerveuses sensorielles périphériques innervant les autres viscères, y compris les tissus les plus difficiles tels que les os. Par ailleurs, ces méthodes électrophysiologiques ne peut pas être utilisé pour déterminer l'expression de la protéine non excitabless dans les zones périphériques des fibres nerveuses sensitives. Par conséquent, immunomarquage d'échantillons de tissus périphériques / viscérale pour fivers nerveuses sensorielles fournit la meilleure façon possible afin de déterminer l'expression de protéines spécifiques de l'intérêt pour ces fibres nerveuses. Jusqu'ici, la plupart des études d'expression de protéines dans les neurones sensoriels ont utilisé immunomarquage procédures dans les ganglions sensitifs, où l'information est limitée à l'expression de protéines spécifiques dans le corps cellulaire de certains types ou sous-ensembles de neurones sensoriels. Nous rapportons ici les méthodes détaillées / protocoles pour la préparation d'échantillons de tissus périphériques / viscérale pour l'immunocoloration des périphériques fibres nerveuses sensitives. Nous détail les méthodes spécifiquement pour la préparation de la peau ou plantaire biopsie et d'os (fémur) les articles de la souris pour l'immunocoloration des périphériques fibres nerveuses sensitives. Ces méthodes ne sont pas seulement essentiels pour la détermination qualitative de l'expression des protéines dans les neurones sensoriels périphériques, mais aussi fournir une méthode de dosage quantitatif pourdéterminer les changements dans les niveaux d'expression de protéines dans des types spécifiques ou des sous-ensembles de fibres sensorielles, ainsi que pour déterminer les modifications morphologiques et / ou anatomiques dans le nombre et la densité des fibres sensorielles au cours de divers états pathologiques. De plus, ces méthodes ne sont pas confinés à la coloration des fibres nerveuses sensorielles que, mais peut aussi être utilisé pour la coloration des types de fibres nerveuses dans la peau, les os et autres tissus viscéraux.

Protocole

1. Perfusion des animaux

Toutes les procédures réalisées sur l'animal dans cette étude sont approuvées par le soin des animaux et du Comité institutionnel Utilisation de l'Université de l'Iowa, et suivre les directives du NIH pour l'utilisation d'animaux dans la recherche.

1. Le jour avant la perfusion, préparer 1 L de tampon phosphate (0,2 M PB en double H ₂ O distillée, pH 7,4), et conserver à 4 ° C. Il sera utilisé pour les processus de perfusion et de post-fixation.
2. Le jour de la perfusion, préparer 500 ml de paraformaldéhyde 4,0% dans 0,1 M PB (PFA, pH 7,4) la solution de fixation, d'un volume suffisant p....

Discussion

Ici, nous avons détaillé les méthodes de préparation de la peau des souris et des coupes de tissus osseux pour immunomarquage et la détection des périphériques fibres nerveuses sensitives. Les sections produite à partir de biopsies plantaires contiennent à la fois la peau glabre et poilue, ce qui signifie que le protocole peut être utilisé sur tout type de peau. Ces techniques peuvent également être employées pour colorer les autres types de cellules dans ces tissus (leucocytes, vasculaire endothélium, muscle lisse, ent.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Nom du produit	Tapez	Société	No de catalogue	Commentaire
3mm Harris Micro-Punch	Matériel	Ted Pella	15094
Pompe à perfusion	Matériel	VWR International	23609-170
Paraformaldéhyde	Réactif	Fisher Scientific	T353
L'acide picrique	Réactif	Sigma-Aldrich	239801
Composé Embedding octobre	Réactif	Tissue-Tek	4583
Cyto-Freeze aérosol cryogénique	Matériel	Société de contrôle	3118
Sérum de chèvre	Réactif	Sigma-Aldrich	G9023
Bac Incubation et couvercle pour Immunocoloration (Large)	Matériel	RPI Corp	248270 (bac) 248 270-A (couvercle)
Stylo ImmEdge barrière hydrophobe	Matériel	Vector Laboratories	H-4000
Brosses à cheveux de Camel (# 1 épaisseur)	Matériel	Ted Pella	11859
Pro-Long Or Milieu de montage	Réactif	Invitrogen	P36930