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1. Ensemencement des cellules
- Avant de commencer, faites chauffer le milieu de culture, le PBS 1X et la trypsine dans un bain d'eau à 37 ˚ C
- Prenez les cellules de l'incubateur et aspirer le milieu.
- Appliquez doucement 5 ml de PBS 1X sur les cellules pour les laver.
- Aspirer le PBS 1X et appliquer 1 ml de trypsine EDTA contenant 0,025%.
- Tournez doucement la plaque pour avoir une distribution uniforme de la trypsine.
- Placez les cellules dans l'incubateur à 37 ˚ C pendant 5-10 minutes (selon le type de cellule). Du temps de vérifier le temps si les cellules sont détachées en secouant la plaque.
- Resuspendre les cellules dans 10-20 ml de milieu et de les recueillir dans un tube Falcon de 50 ml.
- Compter les cellules en utilisant un compteur Beckman. Le nombre de cellules devrait être suffisant pour assurer une confluence d'environ 60-70%.
- Assiette des cellules et leur permettent de graines pendant 6-8 heures.
2. Transperfection
- Avant la transfection, réchauffer une aliquote de milieu sans sérum dans un bain d'eau à 37 ˚ C.
- Porter le gène X-treme de 9 à température ambiante.
- Déposer le milieu sans sérum dans des tubes Eppendorf 2 (1 = 1 tube de transfection).
- Déposer le gène X-treme 9 dans l'attention du milieu sans sérum payer que la pointe ne touche pas le mur en plastique de l'eppendorf et incuber pendant 5 minutes. En attendant de préparer deux mélanges d'ADN: dans un tube mélanger les plasmides pour Renilla, luciole et une lutte antivectorielle vide, dans un autre tube de Renilla, luciole et le chaperon moléculaire.
- Ajouter le mélange d'ADN à chaque Eppendorf contenant milieu sans sérum + X-treme Gene 9, vortex et incuber à température ambiante pendant 20 minutes.
- Ajouter goutte à goutte de chaque mélange sur chaque assiette et laisser incuber pendant 24 heures à 37 ° C et CO 2 5%
3. Fractionnement des cellules
- 24 heures après transfection, trypsinize les cellules comme décrit dans 1.4 à 1.6 et les diluer à une confluence finale de 60-70% dans une plaque à 6 puits.
- Préparer une plaque pour le contrôle non choqué et que de nombreuses plaques que les points de temps de récupération qui doivent être analysés, comme l'a montré dans la Fig. 2.
4. Choc thermique
- Pour un choc thermique, préchauffer le sérum contenant du milieu dans un bain d'eau à 37 ˚ C.
- Préparer «tampon de choc thermique» par dilution dans la cycloheximide milieu contenant du sérum à une concentration finale de 20 ug / ml et à 20 mM MOPS.
- Maintenant sortez les plaques de l'incubateur et aspirer le milieu.
- Ajouter à chaque puits 1 ml de «tampon de choc thermique», et incuber pendant 30 minutes à 37 ˚ C et 5% de CO 2 (inclure également la plaque de référence dans ce traitement). Cela arrêtera la synthèse de novo de protéines.
- En attendant le passage sur un bain d'eau et mettre le température à 45 ˚ C.
- Après incubation, sceller le couvercle des plaques avec du Parafilm préalablement coupés en bandes. La plaque de référence (100% de refolfed Firefly) est laissé dans l'incubateur.
- Incuber les plaques à 45 ˚ C pendant 30 minutes.
- Retirez les plaques du bain d'eau, retirez le parafilm et mettre les plaques de revenir à l'incubateur pour permettre la récupération.
- A chaque récolte point dans le temps les cellules et les laver dans du PBS 1X par centrifugation à 2000Xg pendant 1 minute à 4 ˚ C.
5. La lyse cellulaire et le dosage de luciférase
- Pour une lyse cellulaire efficace, snap figer le culot cellulaire dans l'azote liquide.
- Ajouter 200 ul de tampon de lyse passive dilué à 1:5 dans l'eau bidistillée dans un tube de verre.
- Ajouter 30 ul du lysat cellulaire dans une plaque 96 puits. Chaque échantillon est pipeté en trois exemplaires.
- Seul le «non choqués» des échantillons de référence seront utilisées pourlire l'activité Renilla luciférase, puisque cette étape est utilisé pour vérifier l'efficacité de transfection égaux.
- Préparer les solutions pour le dosage. Pour la solution de luciférine diluer luciférine à une concentration finale de 0,2 mM dans Gly-Gly tampon. Pour diluer le tampon de réaction de la TNT et l'ATP à 1mm concentration finale dans Gly-Gly tampon. Pour un tampon de réaction coelentérazine, diluer coelentérazine à une concentration finale de 0,2 uM dans un tampon de coelentérazine. Conserver la solution luciférine et la lumière du tampon de réaction coelentérazine protégés.
- Maintenant, placez la plaque de 96 puits dans le luminomètre et démarrer le programme «Wallac 1420 Workstation.
- Introduire le PUMP1 dans le tube contenant la solution Falcon coelentérazine. Fermer le couvercle afin qu'aucune lumière ne puisse entrer en contact avec le tube.
- Choisissez dans le menu 'entretien Distributeur »de l'option et cochez PUMP1.
- Sélectionnez l'option 'Fill'.
- Pour modifier la disposition de la plaque choisissez l'option «Explorer le protocole et les résultats» dans le menu. Sélectionnez le protocole et cliquez deux fois dessus. Maintenant, sélectionnez le puits d'être lu.
- Retour à «Wallac Manager 'et cliquez sur" Démarrer ". La réaction entre la luciférase Renilla et son substrat coelentérazine émet de la lumière avec une longueur d'onde maximale de 482 nm.
- Après la lecture, allez sur «l'entretien distributeur» et sélectionnez «vide» et à libérer tous les PUMP1 la solution résiduelle vers le tube.
- Maintenant, déplacez le tube à un tube Falcon contenant de l'eau et de cocher la case "Flush".
- Après l'étape de rinçage, vider le tube en sélectionnant 'vide'.
- Placer le tube d'PUMP1 dans le tube de réaction de tampon faucon et celle de Pump2 dans le tube de luciférine faucon.
- Modifier la mise en assiette.
- Sélectionnez «Remplir» pour PUMP1 et Pump2 du Di 'Spenser entretien »du menu.
- Sélectionnez le protocole et commencer la lecture. La réaction entre la luciférase Firefly et son substrat luciférine émet de la lumière avec une longueur d'onde maximale de 560 nm.
- A la fin de la lecture répéter la procédure vide-Flush-vide pour PUMP1 et Pump2.
- Les résultats sont maintenant disponibles dans le «Wallac 1420 Explorer».
- Chaque expérience est associée à un numéro d'essai, identifiant, mot de commencer et la date de fin.
- Les résultats peuvent maintenant être exportés dans un fichier Excel.
- Pour les calculs, les cellules sont divisées en trois groupes: 1. échantillons de référence non choqué (fixée à 100% de la luciférase de luciole repliée), 2. cellules sans chaperon moléculaire et à un choc thermique; 3. cellules avec chaperon moléculaire et choc thermique.
6. Les résultats représentatifs
Repliement des protéines est directement liée au temps de récupération donc de tester si le système fonctionne Pro Perly, un test doit être effectuée la collecte des cellules à différents temps. Une corrélation directe du temps / pourcentage de repliement indique que l'expérience a été correctement effectuée et représente donc un facteur limitant. Cependant, il faut toujours considéré que le repliement après le choc thermique est un événement saturer et donc une analyse en temps bon parcours doit être effectué avant de commencer toute expérimentation.
Figure 1. Vue d'ensemble de l'expérience. En test in vivo requiert repliement 3 à 4 jours pour être complétée. Le jour 1, les cellules sont ensemencées et transfectées. Les cellules sont lendemain découpée en un format plus petit et le jour 3, ils sont choqués de la chaleur. À ce point est possible d'effectuer le dosage de luciférase juste après la récolte des cellules ou de sauver le culot cellulaire à -80 ° C et effectuer les essais en un autre moment
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Figure 2. Fractionnement cellulaire. Le jour 2 cellules sont réparties dans une plaque à 6 puits. Chaque transfection sera dilué dans un puits afin d'avoir tous la transfection sur la même plaque. Chaque plaque correspond à un temps de récupération, plus particulièrement une plaque de référence non choqué.
Figure 3. Représentant bon résultat. A. Pourcentage de repliement directement mesurée par la luciole activité luciférase. Chaque graphique représente le pourcentage de repliement en l'absence (barres noires) et en présence (barres rouges) d'un chaperon moléculaire à différents moments de récupération. B. Corrélation entre le temps et en l'absence de repliement (ligne noire) et en présence (ligne rouge) du chaperon. Les valeurs r au carré montrent une bonne corrélation.
Dans Fig.3A est montré un résultat représentatif où les cellules ont été collectées de 15 minutes, 30, 45, 60 et 120 après un choc thermique en l'absence (barres noires) et en présence (barres rouges) de chaperon moléculaire. Pourcentage des replié augmente la luciférase avec le temps de récupération prolongée et à la transfection du chaperon moléculaire. La corrélation entre le repliement et l'heure pour le contrôle (figure 3B, la ligne noire) et le chaperon moléculaire de cellules transfectées (figure 3B, la ligne rouge) est montré.
Figure 4. Représentant mauvais résultat. A. Pourcentage de repliement directement mesurée par l'activité luciférase. Chaque graphique représente le pourcentage de repliement en l'absence (barres noires) et en présence (barres rouges) d'un chaperon moléculaire à différents moments de récupération. B. Corrélation entre le temps et en l'absence de repliement et en présence (rouge L) ine du chaperon. Les valeurs de corrélation r au carré indiquent mauvais.
La figure 4A. Montre un résultat représentatif d'une expérience pas correctement effectué. Tant le contrôle (barres noires) et le chaperon moléculaire de cellules transfectées (barres rouges) ne montrent pas une augmentation des protéines de repliement avec le temps. En outre, la transfection du chaperon moléculaire n'a pas abouti à une augmentation de repliement. Cette faible corrélation est confirmée dans la Fig. 4B montrant une valeur r au carré de 0,6619 et de 0,1882 respectivement pour le contrôle (ligne noire) et le chaperon moléculaire de cellules transfectées (ligne rouge).