Transplantation des cellules germinales et de tissus testiculaire xénogreffe chez la souris

Résumé

Protocoles pour la transplantation de cellules germinales et xénogreffe de tissus testiculaires sont décrits. Les résultats des cellules germinales de transplantation dans les pays donateurs dérivé spermatogenèse dans les testicules bénéficiaires et représente un test fonctionnel pour la reconstitution d'identification des cellules souches des spermatogonies (SSC). Tissu testiculaire xénogreffe reproduit le développement des testicules et de la spermatogenèse des espèces des différents donateurs dans les souris receveuses.

Résumé

La transplantation des cellules germinales a été développé par le Dr Ralph Brinster et ses collègues de l'Université de Pennsylvanie en 1994 ^1,2. Ces études avant-gardistes ont montré que la micro-injection de cellules germinales des souris donneuses fertiles dans les tubules séminifères des souris receveuses infertiles résultats dans les pays donateurs dérivé spermatogenèse et la production de spermatozoïdes par l'animal ² destinataire. L'utilisation de mâles donneurs transportant des l'identification gène bactérien β-galactosidase a permis de donneur-dérivée spermatogenèse et la transmission de l'haplotype des bailleurs de fonds à la descendance par ¹ animaux receveurs. Étonnamment, après la transplantation dans la lumière des tubes séminifères, les cellules germinales transplantés ont pu se déplacer à partir du compartiment luminal de la membrane sous-sol où se trouvent les spermatogonies ^3. Il est généralement admis que seuls les SSC sont capables de coloniser la niche et de rétablir la spermatogenèse dans les testicules bénéficiaires. Par conséquent les cellules germinales,la transplantation offre une approche fonctionnelle pour étudier la niche de cellules souches dans les testicules et de caractériser les cellules souches putatives spermatogonies. À ce jour, la transplantation de cellules germinales est utilisée pour élucider la biologie des cellules souches de base, pour produire des animaux transgéniques par manipulation génétique des cellules germinales avant la transplantation ^4,5, pour étudier l'interaction cellules de Sertoli cellules germinales ^6,7, SSC homing et de la colonisation ^{3, 8,} ainsi que la SSC auto-renouvellement et la différenciation ^9,10.

Une transplantation de cellules germinales est également possible dans les grandes espèces ^11. Dans ces derniers, les principales applications sont la préservation de la fertilité, la diffusion de la génétique d'élite dans les populations animales, et la génération d'animaux transgéniques comme l'étude de la spermatogenèse et la biologie de la SSC avec cette technique est logistiquement plus difficile et plus coûteux que chez les rongeurs. La transplantation de cellules germinales à partir de grandes espèces dans les tubes séminifères des souris entraîne dans colonization de cellules du donneur et l'expansion des spermatogonies, mais pas dans leur différenciation complète sans doute en raison de l'incompatibilité du compartiment receveur de cellules somatiques avec des cellules germinales à partir de ¹² espèces phylogénétiquement éloignées. Une approche alternative est la transplantation de cellules germinales à partir de grandes espèces avec leur compartiment somatique environnant. Nous avons d'abord rapporté en 2002, que de petits fragments de tissu testiculaire des mâles immatures transplantées sous la peau dorsale de souris immunodéficientes sont capables de survivre et connaître un développement complet de la production de sperme fertilisation compétente ^13. Depuis lors, tissu testiculaire xénogreffe a été démontré que pour réussir dans de nombreuses espèces et a émergé comme une alternative intéressante à étudier le développement testiculaire et la spermatogenèse des animaux de grande taille chez la souris ^14.

Protocole

PARTIE A. transplantation de cellules germinales chez la souris

1. Préparation de la souris receveuses

1. Les bénéficiaires devraient être immunologiquement tolérantes (soit génétiquement identiques à celles des donateurs ou des immuno-déficients) pour les cellules testiculaires des donateurs.
2. Les bénéficiaires devraient être soit naturellement dépourvue de la spermatogenèse (par exemple W / W ^v souris) ou appauvri des cellules germinales endogènes. L'épuisement des cellules germinales peut être obtenue par irradiation ou médicaments chimiothérapeutiques tels que le busulfan. Dans ce protocole, nous déc....

Discussion

1. La transplantation des cellules germinales

La transplantation des cellules germinales fournit le test ne fonctionne que pour la confirmation sans équivoque de la présence de cellules souches des spermatogonies (SSC) dans une population cellulaire. SSC Seuls peuvent abrite et de coloniser la niche de la SSC à la membrane basale et d'initier des donateurs dérivé spermatogenèse. Germe de la transplantation de cellules ont permis d'étudier et de manipuler des SSC d'une manière sans .......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Nom du réactif	Entreprise	Numéro de catalogue
Collagénase (type IV)	Sigma	C5138
Trypsine-EDTA	Invitrogen	25200-056
DNaseI	Sigma	DN25
DMEM	Invitrogen	31053-028
Trypan bleuissement	Invitrogen	15250-061
Nylon filtre maille	BD Biosciences	352340 (40 um) 352350 (70μm)
Le busulfan	Sigma	B2635
Thin-mur de verre capillaires	Instrument de précision du monde	TW 100-3
Tube BD plyethylene intramedic (PE100)	BD	CA-63018-725
Suture Ethicon soie 6-0	Ethicon	706G
Clips des plaies	BD	427631
Sigmacote	Sigma	SL2
X-gal	Sigma	B4252
Ferrocyanure de Potassium	Sigma	P9387
Ferricyanure de potassium	Sigma	P3667
chlorure de magnésium	Sigma	208337
désoxycholate de sodium	Sigma	D6750
Le N, N-Diméthylformamide	Sigma	D4551
Igepal CA-630	Sigma	18896