Analyse de l'expression de mammifères Linker-histones sous-types

Résumé

Nous décrivons un ensemble de tests pour analyser les niveaux d'expression des histones H1. ARNm de gènes H1 individuels sont mesurés quantitativement par transcription inverse amorce aléatoire basé suivie par PCR en temps réel, alors que la quantification des protéines histones H1 de est obtenue par une analyse HPLC.

Résumé

Linker histone H1 se lie à la particule de noyau nucléosome et l'ADN linker, pour faciliter le pliage de la chromatine dans la structure d'ordre supérieur. H1 est essentielle pour le développement des mammifères ¹ et régule l'expression génique spécifique in vivo ^2-4. Parmi les protéines hautement conservées des histones, la famille des histones H1 est le groupe le plus hétérogène. Il ya 11 sous-types H1 chez les mammifères qui sont différentiellement régulés au cours du développement et dans différents types cellulaires. Ces sous-types H1 comprennent 5 somatiques H1 (H1a-e), le H1 ⁰ remplacement, 4 germinales sous-types de cellules H1 spécifiques, et H1x ^5. La présence de sous-types H1 multiples qui diffèrent de l'affinité de liaison à l'ADN et la capacité compaction de la chromatine ^6-9 fournit un niveau supplémentaire de modulation de la fonction chromatine. Ainsi, l'analyse d'expression quantitative des sous-types H1 individuels, à la fois de l'ARNm et de protéines, est nécessaire pour une meilleure compréhension de la régulation de l'enseignement supérieurstructure de la chromatine ordre et la fonction.

Nous décrivons ici un ensemble de tests conçus pour analyser les niveaux d'expression des sous-types H1 individuels (Figure 1). expression des ARNm de différents gènes variants H1 est mesurée par un ensemble de très sensibles et quantitative RT-PCR (qRT-PCR), qui sont plus rapides, plus précis et nécessitent des échantillons beaucoup moins par rapport à l'approche alternative de l'analyse par Northern blot. Contrairement à la plupart des autres messages d'ARNm cellulaires, les ARNm des gènes les plus histones, y compris la majorité des gènes H1, ​​n'ont pas une longue queue polyA, mais qui contiennent une structure en tige-boucle à la région 3 'non traduite (UTR) ^10. Par conséquent, les ADNc sont préparés à partir d'ARN totaux par transcription inverse en utilisant des amorces aléatoires au lieu d'oligo-dT amorces. En temps réel PCR avec des amorces spécifiques à chaque sous-types H1 (Tableau 1) sont effectuées pour obtenir une mesure hautement quantitative des taux d'ARNm de sous-type H1 individuelles. Expression des gènes de ménage sont analysés comme des contrôles pour la normalisation.

L'abondance relative des protéines de chaque sous-type H1 et histones est obtenue par chromatographie en phase liquide inverse à haute performance (CLHP-PI) l'analyse des histones totaux extraits de cellules de mammifères ^11-13. La méthode par CLHP et les conditions d'élution décrites ici donnent des séparations optimales de sous-types H1 souris. En quantifiant le profil HPLC, nous calculons la proportion relative des sous-types H1 individuels au sein de la famille H1, ainsi que de déterminer le ratio de H1 à nucléosome dans les cellules.

Protocole

1. Préparation de l'échantillon et d'extraction d'ARN

1. Avant l'extraction d'ARN, toutes les surfaces de travail et les pipettes doivent être nettoyées avec de l'éthanol 70% et traité avec une solution de décontamination RNase, tels que la RNase Zap. Cette pratique réduit les risques de contamination de RNase et la dégradation des ARN. Porter des gants pour toutes les procédures.
2. Pour extraire l'ARN à partir de tissus de la souris, disséquer l'organe d'intérêt de la souris euthanasiés, et lavez le tissu en phosphate glacée solution saline tamponnée (PBS: 0,13 M de NaCl, 5 mM de phosphate de sodium dibasique hepta....

Discussion

L'ensemble des analyses présentées ici permettent une analyse complète des niveaux d'expression de mammifères linker sous-types d'histones. Bien conçus qRT-PCR fournir des mesures très sensibles et précises de messages d'ARN à partir des gènes de mammifères histone H1. La partie critique de qRT-PCR pour l'éditeur de liens de sous-type gènes des histones est la préparation de l'ADNc en utilisant une amorce aléatoire basé transcription inverse. ARNm des gènes les plus histones, y compris la plupart.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Nom du réactif	Entreprise	Numéro de catalogue
RNase Zap	Applied Biosystems	AM9780
Réactif Trizol	Invitrogen	15596-018
SuperScriptIII	Invitrogen	18080-051
L'éthanol absolu	Fisher Scientific	BP2818-4
IQ SYBR Green	Bio-Rad	170-8880
RNeasy Mini Kit	Qiagen	74104
Deoxyribonuclease I	Sigma	AMP-D1
Microseal plaque de 96 puits PCR	Bio-Rad	MSP-9605
Joints adhésifs «B» Microseal	Bio-Rad	MSB-1001
Saccharose	Organics Agros	AC40594
Phosphate de sodium dibasique heptahydraté (Na 2 HPO 4 · 7H 2 O)	Fisher Scientific	BP332
Le chlorure de sodium (NaCl)	Américaine bioanalytique	AB01915
Heptahydraté phosphate monosodique (NaH 2 PO 4 · 7H2O)	Fisher Scientific	BP-330
HEPES	Fisher Scientific	BP310
Complete tablette Mini cocktail inhibiteur de la protéinase	Roche Applied Science	11836153001
EDTA	Sigma	E-5134
Fluorure de phénylméthanesulfonyle (PMSF)	Américaine bioanalytique	AB01620
Nonidet-40 (NP-40)	Américaine bioanalytique	AB01425
Le chlorure de potassium (KCl)	Fisher Scientific	BP366
Tris [hydroxyméthyl aminométhane]	Américaine bioanalytique	AB02000
Le chlorure de magnésium (MgCl2)	Fisher Scientific	BP214
L'acide sulfurique (H2SO4)	VWR	VW3648-3
L'hydroxyde d'ammonium (NH 4 OH)	Organics Agros	AC42330
Bradford Protein Assay	Bio-Rad	500-0001
Acétonitrile	EMD	AX0145-1
L'acide trifluoroacétique (TFA)	JTBaker	9470-01