Analyse quantitative des migrations au hasard des cellules en utilisant la microscopie vidéo time-lapse

Summary

Cette méthode permet le suivi des cellules en temps réel et des mesures quantitatives de différents paramètres de migration cellulaires tels que la vitesse, le déplacement et la vitesse. Contrairement aux méthodes traditionnelles, cette approche temps réel n'est pas basée sur des mesures quantitatives de point de terminaison de migration, mais plutôt il permet de surveiller et de calcul des paramètres différents en permanence.

Abstract

La migration cellulaire est un processus dynamique, ce qui est important pour le développement embryonnaire, la réparation des tissus, la fonction du système immunitaire, et l'invasion tumorale ^{1, 2.} Lors de la migration directionnelle, les cellules se déplacent rapidement en réponse à un signal chimiotactique extracellulaire, ou en réponse à des signaux intrinsèques ³ prévus par le mécanisme de base motilité. La migration aléatoire se produit lorsque une cellule possède une faible directivité intrinsèque, permettant aux cellules d'explorer leur environnement local.

La migration cellulaire est un processus complexe, dans la cellule de réponse initial est soumise à la polarisation et s'étend saillies dans le sens de la migration ^2. Les méthodes traditionnelles de mesure de la migration, comme le test de migration Boyden chambre est une méthode simple pour mesurer la chimiotaxie in vitro, qui permet de mesurer la migration comme un résultat point de fin. Cependant, cette approche ne permet ni la mesure des paramètres de migration individuels, elle ne permet pas de visualisation de changements morphologiques que la cellule subit lors de la migration.

Ici, nous présentons une méthode qui nous permet de contrôler les cellules migrent en temps réel en utilisant la vidéo - microscopie laps de temps. Depuis la migration et l'invasion cellulaire sont caractéristiques du cancer, cette méthode sera applicable dans l'étude de la migration des cellules cancéreuses et l'invasion in vitro. La migration aléatoire des plaquettes a été considéré comme l'un des paramètres de la fonction plaquettaire ^4, d'où cette méthode pourrait également être utile dans l'étude des fonctions plaquettaires. Ce test présente l'avantage d'être rapide, fiable, reproductible, et ne nécessite pas d'optimisation du nombre de cellules. Afin de maintenir des conditions physiologiquement appropriées pour les cellules, le microscope est équipé d'alimentation en CO ₂ et d'un thermostat de température. Le mouvement cellulaire est contrôlé par la prise de vue à l'aide d'une caméra montée sur le microscope à intervalles réguliers. La migration cellulaire peut être calculée en mesurant la vitesse moyenne et unedéplacement mo yen, qui est calculée par un logiciel Slidebook.

Protocol

1. Préparation de la plaque recouverte de collagène

1. Diluer collagène à une concentration finale de 10 pg / ml dans Opti-Mem médias.
2. Manteau plaques à 6 puits avec du collagène, en ajoutant 1,5 ml de l'étape 1 dans chaque puits. Incuber une nuit à 4 ° C.
3. Le lendemain, laver la plaque 2 fois avec du phosphate de 1x solution saline tamponnée (PBS) et de les stocker dans du PBS.

2. Préparation des cellules et de semis sur une plaque à 6 puits

Note: Utiliser les médias chauds et PBS afin d'assurer des conditions optimales pour le mouvement des cellules

Discussion

Le dosage en temps réel la migration aléatoire permet précis, sensible, l'analyse des paramètres de migration cellulaires tels que la vitesse et le déplacement. Cette méthode n'est pas limitée à la valeur finale de mesure de point, donc il est plus quantitative. Depuis, les cellules sont surveillés en milieu DMEM avec du sérum normal de; il réduit l'effet délétère de plus d'incubation dans le sérum des médias libres. Il a été montré que la migration des cellules dépend de la mise en forme et la rupture d.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nom du réactif	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
DMEM	Thermo Scientific	SH30243.01
FBS	Gemini Bio-Produits	100-106
Opti-Mem	Invitrogen	31985-070
Collagène	BD	354231
Microscope avec la chambre de cellules vivantes et automatisé contrôleur de platine XY	Olympe	Olympus 1X81
Chambre de contrôle de l'environnement	Neue	Chambre Neue Live Cell	La nôtre a une coutume construit plateau rectangulaire plaque en verre pour l'optique appropriées par le haut de la chambre. La forme rectangulaire accueille plaques multi-puits utilisés dans bon nombre de nos expérits.
Automatique XY	Avant	Avant Proscan	Cela permet de multiplier retour précise positions XY sélectionnés au cours de la microscopie laps de temps.
Appareil photo		Hamamatsu EM appareil C9100
Logiciel	Généralement achetés par l'intermédiaire du fournisseur de microscope comme Olympus	5 Réserver diapositives