Microcapsules d'alginate comme une plate-forme 3D pour la Propagation et différenciation des cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) à différentes lignées

Résumé

Nous avons optimisé une technique de microencapsulation comme une plate-forme efficace pour la propagation 3D et la différenciation des cellules souches embryonnaires à l'endoderme et dopaminergiques (DA) des neurones. Il fournit aussi une occasion pour le système immunitaire des cellules d'isolement de l'hôte lors de la transplantation. Cette plate-forme peut être adaptée à d'autres types cellulaires.

Résumé

Cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) sont en train de devenir une source alternative intéressante pour la thérapie de remplacement cellulaire, car elles peuvent être multipliées en culture indéfiniment et différencié à tous les types de cellules dans le corps. Différents types de biomatériaux ont également été utilisés dans les cultures de cellules souches pour fournir un microenvironnement imitant la niche de cellules souches ^1-3. Le dernier point est important pour la promotion de la cellule à cellule d'interaction, la prolifération cellulaire et la différenciation en lignées spécifiques ainsi que l'organisation des tissus en fournissant un en trois dimensions (3D) environnement ⁴ tel que l'encapsulation. Le principe d'encapsulation cellulaire implique le piégeage de cellules vivantes dans les limites de membranes semi-perméables dans des cultures 3D ^2. Ces membranes de permettre l'échange des nutriments, l'oxygène et des stimuli à travers les membranes, tandis que les anticorps et les cellules immunitaires de l'hôte qui sont plus grandes que la taille des pores capsule sont exclus ^5. Ici, nous avons préenvoyé une approche à la culture et de différencier les CSEh neurones dopaminergiques dans un microenvironnement 3D utilisant des microcapsules d'alginate. Nous avons modifié les conditions de culture de ² à accroître la viabilité des CSEh encapsulé. Nous avons précédemment montré que l'ajout de p160-Rho-associé superhélice kinase (ROCK) inhibiteur, Y-27632 et du foetus humain fibroblastes milieu conditionné de remplacement du sérum (HFF-CM) à la plate-forme 3D a considérablement amélioré la viabilité des CSEh encapsulé dans lequel les cellules expriment définitives gènes marqueurs endodermiques ^1. Nous avons maintenant utilisé cette plate-forme 3D pour la propagation de la différenciation des CSEh et efficace pour les neurones dopaminergiques. Analyses d'expression des protéines et des gènes après la phase finale de la DA de la différenciation neuronale a montré une expression accrue de la tyrosine hydroxylase (TH), un marqueur de neurones DA, plus de 100 plis au bout de 2 semaines. Nous avons supposé que notre plate-forme 3D utilisant des microcapsules d'alginate peut être utile d'étudier la prolifération et la différenciation dirigéedes CSEh à des lignées différentes. Ce système 3D permet également la séparation des cellules nourricières de CSEh au cours du processus de différenciation et possède également un potentiel pour le système immunitaire d'isolement lors de la transplantation à l'avenir.

Protocole

Toutes les procédures ci-dessous sont effectuées en utilisant des techniques aseptiques à l'intérieur d'un cabinet de classe II prévention des risques biotechnologiques. Réactifs et équipements utilisés sont répertoriés dans les tableaux ci-dessous.

1. Préparation d'alginate 1,1% (p / v)

1. Ajouter 0,275 g de l'alginate de sodium purifié (haute teneur en acide glucuronique ≥ 60%, la viscosité> 200 mPa.s, et l'endotoxine ≤ 100 UE / g) dans un tube stérile de 50 ml et ajouter 25 ml de solution stérile 0,1% de gélatine préparée plus tôt (0,5 g gelatin/500 ml milli-Q H ₂ O et dissous par autoclavage).

Discussion

Plusieurs études utilisant des cellules souches embryonnaires de souris et de CSEh ont démontré les avantages de système de culture 3D dans les biomatériaux et ingénierie tissulaire ^2,3. Nous avons utilisé des microcapsules d'alginate de calcium en tant que plate-forme appropriée pour étudier la propagation 3D et la différenciation des CSEh en comparaison à l'alginate de baryum depuis CSEh ont montré significativement plus élevé lorsque la viabilité encapsulé dans de l'alginate de calcium que l.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Nom du réactif	Entreprise	Numéro de catalogue	Remarques
Alginate (Pronova UP MVG)	NovoMatrix	4200101	haute teneur en acide glucuronique ≥ 60%, une viscosité> 200 mPa.s, et l'endotoxine <100 UE / g
Gélatine	Sigma-Aldrich	G1890-100G
NaCl à 0,9%	Baxter Healthcare	AHF7123
Type de J1 bourrelet générateur	Nisco Engineering Inc	SPA-0447
Pompe à seringue multi-Phaser	New Era Pump Systems Inc	Modèle NE-1000
Ezi-Flow Débitmètre médicale	Systèmes Gascon	G0149
Y-27632	Merck	688000
L'albumine sérique humaine	Sigma-Aldrich	A4327-1G
Accutase	Millipore	SCR005
14G x 2 "cathéter IV	Terumo	SR-OX1451C
Knockout-DMEM	Invitrogen	10829-018	Pour SR moyenne (de base)
Glutamax-je	Invitrogen	35050-061	Pour SR moyennes (2 mM)
Remplacement Knockout Sérum	Invitrogen	10828-028	Pour SR moyenne (20%)
La pénicilline-streptomycine	Invitrogen	15070063	Pour SR moyenne (2,5 U / ml)
Insulin-transferrine-Sélénium (SON)	Invitrogen	41400045	Pour SR moyenne (1x)
β-mercaptoéthanol	Invitrogen	21985-023	Pour SR moyenne (0,1 mM)
MEM NEAA Solution	Invitrogen	11140-050	Pour SR moyenne (5 mM)
Glasgow Milieu Essentiel Minimum	Invitrogen	11710035	Pour le milieu DA différenciation neurale (basale)
Remplacement Knockout Sérum	Invitrogen	10828-028	Pour le milieu DA différenciation neurale (10%)
Pyruvate de sodium	Invitrogen	11360070	Pour le milieu DA différenciation neurale (1 mM)
MEM NEAA Solution	Invitrogen	11140-050	Pour DA nmilieu de différenciation EURAL (0,1 mM)
β-mercaptoéthanol	Invitrogen	21985-023	Pour le milieu DA différenciation neurale (0,1 mM)
Sonic hedgehog (SHH)	R & D Systems	1314-SH-025/CF	Pour DA différenciation neurale (100 ng / ml)
Fibroblast growth factor 8a (FGF8a)	R & D Systems	4745-F8-050	Pour DA différenciation neurale (100 ng / ml)