Écrans à haut débit et faible avec Les nématodes à galles Meloidogyne spp.</em

Résumé

Deux méthodes distinctes pour les plantes d'écran avec les nématodes à galles sont décrits. Les approches décrites comprennent à haut débit écrans avec les nématodes d'une manière non destructive de faciliter l'utilisation de ces plantes dans les programmes de sélection.

Résumé

Les nématodes à galles (Meloidogyne genre) sont des parasites de plantes obligatoires. Ils sont extrêmement polyphages et considéré comme l'un des nématodes parasitaires importantes économiquement la plus. Le microscope de deuxième stade juvénile (J2), mué une fois dans l'œuf, est le stade infectieux. Les J2 éclore des oeufs, se déplacer librement dans le sol dans un film d'eau, et de localiser les extrémités des racines d'espèces végétales adaptées. Après avoir pénétré dans la racine de la plante, ils migrent vers le cylindre vasculaire où ils établissent un site d'alimentation et d'initier l'alimentation à l'aide de leurs stylets. Le site d'alimentation multicellulaire est composé de plusieurs cellules multinucléées appelées agrandies des cellules géantes qui sont formés à partir de cellules qui ont subi une caryocinèse (répété la mitose) sans cytokinèse. Cellules du péricycle voisins diviser et agrandir la taille donnant lieu à une galle typique ou d'un noeud racine, le symptôme caractéristique de l'infection nématode à galles. Une fois que l'alimentation est initiée, J2 devenus sédentaires et nondergo trois mues supplémentaires à devenir des adultes. La femelle adulte pond des œufs 150-250 dans une matrice gélatineuse sur ou sous la surface de la racine. A partir des oeufs infectieux J2 nouvelles éclosent et commencer un nouveau cycle. Le cycle de nématodes à galles vie est achevée en 4-6 semaines à 26-28 ° C.

Ici, nous présentons le protocole traditionnel pour infecter les plantes, cultivées dans des pots, avec les nématodes à galles et deux méthodes pour tests à haut débit. Le premier haut-débit méthode est utilisée pour les plantes à petites graines comme la tomate alors que le second est pour les plantes à grosses graines telles que le haricot niébé et commune. Les grosses graines soutenir la croissance des semis prolongé avec supplément nutritif minimal. Le dosage de débit première haute utilise plantules cultivées dans du sable dans des plateaux tandis que dans les plantes d'essai seconds sont cultivées dans des sachets en l'absence de sol. Le sachet croissance des plants est faite d'une mèche 15,5 x 12,5 cm papier, pliée vers le haut pour former une auge de 2 cm de profondeur dans lequel la semence ou des semis est placé. Lamèche de papier est contenue dans un sachet en plastique transparent. Ces sachets de croissance permettent une observation directe des symptômes d'infection des nématodes, des galles sur les racines et la production de masse d'œufs, sous la surface d'une pochette transparente. Ces deux méthodes permettent l'utilisation des plantes blindés, après le phénotypage, pour le franchissement ou la production de semences. Un avantage supplémentaire de l'utilisation de sachets de croissance est le faible encombrement, car sachets en plastique sont stockés dans des dossiers suspendus disposés dans des casiers.

Protocole

1. La croissance des semis de tomates en pots et plateaux

1. Pour les essais en pot, les graines de tomates de plantes dans un pot dans un sol riche en matière organique comme le mélange de soleil. Maintenir dans une serre à 22-28 ° C. Après la germination, fertiliser une fois par semaine avec Miracle-Gro.
2. Environ deux semaines après la germination, à deux vrai stade de la feuille, transplanter individuellement les plantules dans des pots (10 cm de diamètre et 17 cm de profondeur) remplis de terre sablonneuse stérile contenant du sable 90% et 10% mélange organique. Ajouter Osmocote engrais à libération lente et à maintenir dans une serre à 22-28 ° C pendant deux semaines. Continuer à fertiliser les plantes une fois par semaine avec Miracle-Gro.
3. Pour les écrans à haut débit, des graines de plantes directement dans des bacs dans le sol sablonneux, de couvrir le bac avec une pellicule de plastique jusqu'à la germination et de maintenir comme ci-dessus. Après la germination, ajouter Osmocote engrais à libération lente et fertiliser une fois par semaine avec Miracle-Gro.

2. La croissance du niébé dans des sachets de semis

1. Seeds sont soit mises à germer dans une boîte de Pétri, bordée de plusieurs couches de papier Kimwipe, et transférés individuellement à poches ou placés directement dans la rainure du papier de la poche et ont germé.
2. Placez les sachets dans un dossier suspendu en plastique, deux par dossier, et d'organiser les dossiers dans un rack en position verticale. Placer le support dans une chambre à environnement contrôlé maintenu à une température de 25-28 ° C et 16 h lumière / 8 h cycle d'obscurité. Crémaillères peuvent également être maintenu dans une serre, mais nécessitent une feuille ou papier rigide couvercle placé au-dessus de la grille sur les deux côtés des tiges des plantes, afin de réduire les risques de contamination fongique.
3. Les sachets d'eau une ou deux fois par jour avec de l'eau par osmose inverse. Environ 10 à 14 jours après le semis, quand un système racinaire adéquat avec des racines tertiaires a développé (Figure 1), les plants sont prêts pour l'inoculation.

3. Extraction des œufs de nématodes

Extraction de l'eggs de racines infectées est modifiée à partir d'un protocole développé par Hussey et Barker (1973).

1. Trois à quatre jours avant l'inoculation des nématodes, d'extraire les œufs de nématodes à galles des racines de tomate infectées. Avant de commencer l'extraction d'oeufs, lavez la zone de travail à l'eau chaude pour éviter la contamination. Aussi laver à l'eau chaude a. Mélangeur, deux seaux, un support en treillis métallique, un maillet en caoutchouc, trois tamis de 425, 90 et 25 um d'ouverture, une éprouvette graduée et les ciseaux
2. Empilez les tamis de haut en bas dans l'ordre suivant: 425, 90 et 25 um d'ouverture. Les oeufs seront recueillis sur le tamis de 25 um au fond. Mettez les tamis sur un treillis métallique pris en charge dans un évier. Mettre un seau sous le treillis métallique pour recueillir la solution d'exécution à travers.
3. Couper le dessus de la plante infectée (s), utilisés comme source de l'inoculum, et le jeter. Retirez délicatement la plante du pot. Laver les racines en les trempant dans un seau en plastique rempli d'eau. Rincer les racines supplémentaires en vertu de courirNing eau jusqu'à ce que les particules de sol sont emportés par les racines.
4. Couper les racines avec des ciseaux en petits morceaux. Éliminer la racine pivotante.
5. Mettez les racines hachées à partir d'une seule plante dans un grand pot en plastique avec un couvercle, ajoutez juste assez solution javellisée à 10% pour couvrir les racines et fermez le couvercle.
6. Agiter le bocal contenant les racines pendant 2 min.
7. Ouvrez le bocal et verser les racines sur le tamis supérieur et laver avec un tuyau attaché à une buse de brumisation. Lavez bien jusqu'à ce que tout l'odeur de javel ait disparu. Utilisez un maillet pour enfoncer les côtés des tamis pour éviter le colmatage des pores de tamis.
8. Retirer le tamis supérieur et rincer les débris sur le deuxième tamis.
9. Retirer le deuxième tamis et recueillir les débris fines, qui comprend les oeufs, de l'dernier tamis. Avec un léger courant d'une bouteille d'eau, déplacer les débris d'un côté du tamis. Recueillir les débris et les œufs dans un bécher propre avec une quantité minimum d'eau.
10. Tamisez une fois de plus l'eau recueillie dans leseau à travers le tamis 25 um pour recueillir les œufs qui auraient pu échapper. Rincez bien avec de l'eau et de recueillir dans le même bécher.
11. Jeter les débris végétaux de la grille supérieure et se laver soigneusement tous les trois tamis avec de l'eau sous pression. Ne touchez pas la partie des mailles des tamis car il peut fausser la taille des pores.

4. Œufs de nématodes d'incubation

1. Tapisser un panier métallique propre avec quelques couches de papier Kimwipe et tenir sur un plat en verre de Petri. Permettre à une distance de 1 cm entre le fond du panier et le plat.
2. Verser les œufs de nématodes extraits sur le papier dans le panier métallique. Ajouter suffisamment de liquide pour que le fond du panier de fil touche la surface de l'eau, mais n'est pas immergé dans l'eau. Couvrir le dessus avec un couvercle en plastique.
3. Chaque jour, vérifier l'évaporation de l'eau et ajouter un peu d'eau dans la boîte de Pétri de sorte que le fond du panier touche l'eau. Cela permettra d'éviter les œufs de se dessécher.
4. Chaque autre jour, de recueillir l'water qui contient les J2 des boîtes de Pétri dans un bécher. S'il n'est pas utilisé immédiatement, il faut aérer l'inoculum recueillies à la température ambiante en utilisant une alimentation en air de laboratoire ou de l'air générée par une pompe d'aquarium. Utilisez l'inoculum aéré dans les 2 jours. J2 peuvent être collectées à partir de l'éclosion mis en place sur une période de 6-8 jours.

5. Infection des racines de tomate dans des pots et d'évaluation des maladies infectieuses

1. Utilisation trois aliquotes des nématodes collectées pour compter le nombre de J2 dans une glissière de comptage ou plat, calculer la moyenne et de déterminer le volume désiré pour l'inoculation. Typiquement 3000 J2 sont utilisées par plante dans des pots et 500 J2S pour les plantes cultivées en bacs de semis.
2. Incorporer l'inoculum sur une plaque d'agitation magnétique à faible vitesse.
3. Avant de vous inoculer les plantes, assurez-vous que le sol est humide mais pas trop humide. Pour l'inoculation pot, faire trois trous d'environ la moitié du pot de profondeur dans le sable autour de chaque système de racine de tomate à l'aide d'un crayon (Figure 2 ). Inoculer chaque plante en fournissant les J2 dans les trois trous à l'aide d'une pipette. Ensuite, recouvrir les trous.
4. Pour les écrans à haut débit dans les bacs, utiliser une aiguille pointe modifiée scellée avec des trous sur les côtés collés à une pointe de 5 ml pipette le long d'une pipette (Figure 3) pour fournir les J2 dans le sol. Alternativement, les nématodes peuvent être livrés que dans l'étape 5.3.
5. Maintenir les plantes dans une serre à 24-27 ° C pendant six à huit semaines. Continuer à fertiliser deux fois par mois avec Miracle-Gro.
6. Pour l'évaluation de l'infection, retirer soigneusement les plantes des pots et laver les racines (comme décrit dans l'étape 3.3).
7. Colorer les masses d'œufs bleus en immergeant les racines de 1 mg / L érioglaucine, pendant 15 min.
8. Rincez les pieds dans l'eau et d'évaluer en comptant les masses d'œufs colorés sur le système racine individuelle. Une loupe bureau lumineux peut être utilisé pour aider à visualiser les masses d'œufs.
9. Si les plantes blindés sont nécessaires pour g en outreétudes enetic, ne coupez pas les sommets avant le lavage des racines pour l'évaluation. Après la coloration, et le comptage des masses d'œufs, repiquer les plantules dans un sol organique, taillez les sommets fortement à réduire la transpiration, et de maintenir dans une serre.

6. Infection des racines du niébé dans les poches et d'évaluation des maladies infectieuses

1. Comptez le inoculum de nématode et remuer sur une plaque d'agitation magnétique, comme décrit précédemment.
2. Retirez les sachets des dossiers suspendus et les placer sur une surface horizontale. Inoculer chaque sachet de 1500 J2 dans 5 ml. Soulevez le couvercle en plastique de la poche et de distribuer les nématodes uniformément sur la surface des racines.
3. Gardez les sachets dans une position horizontale pendant 24 h après l'inoculation, recouvert de papier noir pour exclure la lumière, puis revenir à des dossiers suspendus dans la chambre de croissance.
4. Arroser les plantes selon les besoins, une ou deux fois par jour, avec demi-concentration de la solution de Hoagland (Hoagland et Arnon, 1950; Tableau 1 forte) jusqu'à ce qu'une réponse à l'engrais est observée, écologisation feuillage généralement renforcée et la croissance des pousses plus énergique. Habituellement, les plantes sont arrosées avec une demi-force Hoagland 3 jours dans une rangée. Ensuite, garder les sachets humide avec de l'eau.
5. Environ 30 jours (intervalle de 28-35 jours) après l'inoculation, infuser chaque sachet avec environ 10-20 ml de 75 mg / L érioglaucine. Gardez les sachets inondées avec le colorant dans une position horizontale pendant la nuit.
6. Égoutter les poches et d'évaluer les systèmes racinaires en comptant les masses d'œufs en vertu d'une loupe bureau éclairé.
7. Si les plantes blindés sont nécessaires pour d'autres études génétiques ou de travail d'élevage, retirez soigneusement les racines du papier, la transplantation dans un sol organique dans des pots et de maintenir dans une serre.

7. Les résultats représentatifs

Les étapes appropriées de plants de tomates et de niébé pour des inoculations de nématodes pour les deux systèmes décrits sont illustrés aux figures1 et 2. En outre, des exemples de bien-infectés racines de tomate et le niébé sont présentés dans les figures 4 et 5. Comme dans la plupart des écrans de résistance aux maladies, il est conseillé d'utiliser au moins 6-10 plantes par génotype pour l'inoculation des nématodes pour calculer la moyenne du taux d'infection. Variation de l'infection des nématodes entre les plantes, de la même génotype, peut être réduite en utilisant la taille uniforme des plantes et la quantité exacte et la distribution de l'inoculum.

L'utilisation de plateaux et de pochettes de croissance permet de dépister des centaines de milliers de plantes dans un espace de croissance faible. Sachets de croissance aussi rapide et efficace de permettre l'évaluation non destructive des infections de nématodes à galles sans avoir besoin de racines de lavage (Figure 4).

Figure 1. Une plante vieille de deux semaines niébé cultivé dans une poche et prêt pour l'utilisateur root-knot nématodestode inoculation.

Figure 2. Une plante de tomate trois semaines d'âge prêt à être ensemencé nématode à galles.

Figure 3. Une aiguille modifié et pointe de la pipette utilisée pour l'inoculation à haut débit de nématodes. Le fond d'une aiguille a été scellé et trois séries de trous ont été forés dans l'aiguille à l'aide d'un faisceau laser. Ensuite, l'aiguille modifiée a été collé à un bout de 5 ml pipette.

Figure 4. Un système de racine de tomate infectée par les nématodes à galles.

Figure 5. Un système racinaire du niébé avec les masses d'œufs colorés avec érioglaucine 30 jours post-inoculation augmenté à28 ° C.

Discussion

Il ya deux étapes essentielles pour un écran de nématodes succès: la préparation d'un inoculum très infectieux et l'utilisation de plantes au stade de développement approprié. Taux d'éclosion des œufs de nématodes Meloidogyne est très variable et se situe entre 5 à 50%. Par conséquent, pour obtenir des niveaux optimaux de trappe et J2 très infectieux, une attention particulière doit être accordée à l'extraction d'oeufs à couver et des procédures. Oeufs doit être exposé à de blanchiment pendant une période de temps minimum et de blanchiment doit être rincé et à partir du mélange de racine. Une fois l'éclosion des œufs, la suspension contenant les œufs ne doivent pas être immergé dans l'eau. En outre, d'éviter de renverser les oeufs dans le plat sous-jacent de Petri où les juvéniles éclos sont recueillis. Une façon pour éviter de renverser les œufs pendant le processus d'éclosion est de ne pas ajouter de l'eau directement à la Kimwipe que le papier peut se rompre. Au lieu de cela, ajouter l'eau directement à la boîte de Petri.

Pour de meilleurs résultats, utilisez J2 fraîchement écloses. Si le hatctaux de h est faible et plus l'inoculum est nécessaire, J2 peut être conservé à 15 ° C pendant une période plus longue. Réchauffez l'inoculum stocké à température ambiante pour faire revivre les nématodes avant l'inoculation. Cependant, ne pas stocker les J2 pendant des périodes prolongées, même à 15 ° C comme J2 affamés ne seront pas infecter efficacement.

Les jeunes plantules sont le meilleur stade de développement pour l'inoculation nématode à galles. Toutefois, cela doit être équilibré avec la formation d'un système racinaire suffisant fournir un nombre suffisant de pointes racinaires comme points d'entrée pour les J2. Le maintien optimal des conditions de croissance des plantes est également critique pour les écrans. Évitez de trop d'arrosage des plantes spécialement celles qui sont cultivées dans des sachets. Au cours de l'arrosage des sachets, comme indiqué par l'eau stagnante dans le fond de la poche, peut favoriser la croissance fongique et de diminuer la santé des racines.

Avec à la fois l'évaluation des tests de l'infection des nématodes et le calcul du nombre d'œufs ou système racinaire et les œufs / gramme de fréquenceracine sh peut être effectuée. Pour les tests de tomates, des racines individuelles sont pesés et les œufs extraits comme décrit pour la préparation d'inoculum (section 3). Lors du traitement de grand nombre d'échantillons de plantes, les systèmes racinaires individuelles pourraient être macérés à l'aide d'un mélangeur pour l'extraction de l'œuf. Le nombre d'oeufs doivent être comptés dans au moins trois aliquotes et les œufs / gramme de système de racine fraîche calculée. Pour les tests de poche, le système racinaire est retiré l'insert papier, pesé, et les œufs extrait.