Nous présentons un protocole qui permet de visualiser et d'évaluer quantitativement la morphologie de l'arbre dendritique des cellules de Purkinje individuelles cultivées en culture organotypique de tranche de cervelet. Ce protocole a pour but de promouvoir les études sur les mécanismes de développement de Purkinje cellules dendritiques.
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Article de méthode
L'analyse de la morphologie de Purkinje cellules dendritiques dans les cultures organotypique
Dans cet article
Résumé
Résumé
Cellules de Purkinje sont un système modèle intéressant pour l'étude du développement dendritique, parce qu'ils ont un arbre dendritique impressionnante qui est strictement orienté dans le plan sagittal et se développe surtout dans la période post-natale chez les petits rongeurs 3. En outre, plusieurs anticorps qui sont disponibles marquer les cellules de Purkinje sélective et intensive, y compris tous les processus, avec des anti-calbindine D28K étant le plus largement utilisé. Pour l'affichage de dendrites dans les cellules vivantes, des souris exprimant l'EGFP de manière sélective dans les cellules de Purkinje 11 sont disponibles auprès des laboratoires Jackson. Organotypiques cérébelleuse cultures tranche cellules permettent facilement manipulation expérimentale du développement de Purkinje cellules dendritiques parce que la plupart de l'expansion de l'arbre dendritique Purkinje cellules dendritiques qui se passe réellement pendant la période de culture 4. Nous présentons ici un bref protocole fiable et facile pour la visualisation et l'analyse de la morphologie dendritique des cellules de Purkinje cultivé dans organotypic cultures tranche de cervelet. Pour de nombreuses raisons, une évaluation quantitative de l'arbre de Purkinje cellules dendritiques est souhaitable. Nous nous concentrons ici sur deux paramètres, la taille des arbres dendritiques et les numéros de point de branchement, qui peuvent être rapidement et facilement déterminées à partir anti-calbindine tachées cultures tranche de cervelet. Ces deux paramètres donnent une mesure fiable et sensible des variations de l'arbre dendritique des cellules de Purkinje. En utilisant l'exemple des traitements avec la protéine kinase C PMA (PKC) et l'activateur de récepteurs métabotropiques du glutamate 1 (mGluR1), nous montrons comment les différences dans le développement dendritique sont visualisés et évalués quantitativement. La combinaison de la présence d'un arbre dendritique étendues, les méthodes sélectives et immunomarquage intense, aux cultures organotypiques de tranches qui couvrent la période de croissance dendritique et d'un modèle de souris avec des cellules de Purkinje EGFP expression spécifique des cellules de Purkinje faire un modèle de système puissant pour révéler les mécanismes de dendritique développement.
Protocole
1. La mise en place des cultures organotypiques cérébelleuse Slice
Cultures tranche de cervelet sont préparés dès le premier jour post-natal 8 chiots P souris (8) en utilisant la méthode d'incubation statique 10. Dans notre laboratoire, nous utilisons B6CF1 souris. Dans certaines expériences souris transgéniques ont été utilisés aussi qui expriment l'EGFP sélectivement dans les cellules de Purkinje. La préparation des cultures tranche dure environ 30 minutes par chiot de souris, soit 3 heures pour une portée de 6 chiots souris. Toutes les étapes sont réalisées dans des conditions stériles dans un plan de travail à écoulem....
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Discussion
Les méthodes présentées ici permettent d'étudier le développement de cellules dendritiques Purkinje en culture organotypique de tranche de cervelet et d'évaluer quantitativement l'expansion Purkinje cellules dendritiques en mesurant la dimension des arbres dendritique et le nombre de points de ramification dendritique. Bien sûr, une analyse plus approfondie et quantitatif sophistiqué des dendrites des cellules de Purkinje est possible, par exemple en déterminant la longueur totale dendritique, effectuer une .......
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Déclarations de divulgation
Expériences sur les animaux ont été effectuées en conformité avec la Directive européenne du Conseil du 24 Novembre 1986 (86/609/CEE) et ont été examinés et autorisés par les autorités suisses. Les auteurs n'ont rien à révéler.
Remerciements
Ce travail a été soutenu par l'Université de Bâle, Département de la biomédecine, et le Fonds national suisse (31003A-116 624).
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Nom du réactif | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires (optionnel) |
| Inserts de culture de tissus | Millipore | PICM 03050 PICM ORG50 | Les PICMORG50 inserts ont une jante basse et permettre la visualisation des cultures vivantes au microscope |
| MEM | Gibco, Invitrogen | 11012044 | |
| Glutamax 1 | Gibco, Invitrogen | 35050038 | |
| Basale Medum Aigle | Gibco, Invitrogen | 41010026 | |
| Sérum de cheval | Gibco, Invitrogen | 26050070 | |
| Phorbol 12-myristate 13-acétate (PMA) | Tocris | 1201 | |
| (RS) -3,5-dihydroxy-phénylglycine (DHPG) | Tocris | 0342 | |
| Lapin anti-calbindine D-28K | Swant | CB38 | |
| Anti NeuN, clone A60 | Chemicon, Millipore | MAB377 | |
| Lapin anti-GFP | Abcam | Ab290 |
Références
- Bosman, L. W., Hartmann, J., Barski, J. J., Lepier, A., Noll-Hussong, M., Reichardt, L. F., Konnerth, A. Requirement of TrkB for synapse elimination in developing cerebellar Purkinje cells. Brain Cell Biol. 35, 87-101 (2006).
- Boukhtouche, F., Janmaat, S., Vodjdani, G., Gautheron, V., Mallet, J., Dusart, I., Mariani, J.
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Réimpressions et autorisations
