Article de méthode

Transfert de gènes à l'oreille de souris en développement intérieur par In Vivo Électroporation

DOI :

10.3791/3653

⸱

30 juin 2012

 ,  , 
1Oregon Hearing Research Center, Oregon Health & Science University

Dans cet article

Résumé

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L'oreille interne de souris est un organe placode dérivé sensorielle dont le développement du programme est élaboré pendant la gestation. Nous définissons un In utero Technique de transfert de gène constitué de trois étapes: la souris laparotomie ventrale, la microinjection transutérine, et In vivo Électroporation. Nous utilisons la microscopie vidéo numérique pour démontrer les critiques de techniques expérimentales embryologiques.

Résumé

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L'oreille des mammifères intérieure dispose de 6 épithélium sensoriel distincte: 3 crêtes dans les ampoules des canaux semi-circulaires; macules de l'utricule et le saccule, et l'organe de Corti dans la cochlée enroulée. Le crêtes et macules contiennent des cellules ciliées vestibulaires que transduisent stimuli mécaniques servent les sens particulier de l'équilibre, tandis que les cellules ciliées auditives dans l'organe de Corti sont les principaux transducteurs pour entendre 1. Spécification du destin cellulaire dans ces épithéliums sensoriels et de la morphogenèse des canaux semi-circulaires et la cochlée se déroulera durant la deuxième semaine de gestation chez la souris et sont en grande partie achevé avant la naissance 2,3. Des études de développement de l'oreille de souris intérieure sont effectuées régulièrement par la récolte d'embryons transgéniques à différents stades embryonnaires ou postnatale afin de mieux comprendre la base moléculaire de cellulaire et / ou morphologique phénotypes 4,5. Nous émettons l'hypothèse que le transfert de gène à l'oreille de souris en développement in utero intérieure </ Em> dans le contexte de gain de-et la perte de fonction des études représente une approche complémentaire à la transgenèse souris traditionnelle pour l'interrogation sur les mécanismes génétiques qui sous-tendent le développement des mammifères oreille interne 6.

Le paradigme expérimental de mener des études dérégulation de gènes dans l'oreille interne de souris en développement ont démontré ici résout en trois étapes principales: 1) une laparotomie ventrale; 2) la microinjection transutérine et 3) électroporation in vivo. Laparotomie ventrale est une technique chirurgicale la survie des souris qui permet l'externalisation de l'utérus pour accéder expérimental aux embryons implantés 7. Microinjection transutérine est l'utilisation de verre, biseautées micropipettes capillaires à introduire le plasmide d'expression dans la lumière de la vésicule otique ou otocyst. In vivo électroporation est l'application d'onde carrée, impulsions de courant pour diriger l'expression plasmide dans des cellules progénitrices 8-10.

11. Souris techniques expérimentales embryologiques peut être difficile à apprendre de la prose et les images fixes uniquement. Dans le présent travail, nous démontrons les 3 étapes de la procédure de transfert de gène. La plupart des critiques, nous déployons la microscopie vidéo numérique pour montrer précisément comment: 1) déterminer l'orientation embryon in utero; 2) réorienter embryons à des fins de ciblage des injections à l'otocyst; 3) micro-injection d'ADN mélangé avec un traceur colorant dans la solution otocyst aux jours embryonnaires 11,5 et 12,5; 4) électroporer la otocyst injecté, et 5) embryons d'étiquettes électroporés pour la sélection postnatale à la naissance. Nous fournissons des exemples représentatifs de succès transfectées oreille interne, un guide illustré sur les causes les plus courantes de mauvais ciblage otocyst; discuter de la façon d'éviter les erreurs communes méthodologiques et des lignes directrices actuelles pour l'écriture d'un in utero gène protocole de transfert des soins aux animaux.

Protocole

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1. Laparotomie ventrale

  1. Anesthésier un barrage dont les embryons sont à jour embryonnaire 11,5 (E11.5; midi le jour un bouchon vaginal est détecté, c'est le jour de 0,5 développement embryonnaire) par injection intrapéritonéale de pentobarbital de sodium solution anesthésique (7,5 uL par gramme de poids corporel). Solution de travail anesthésique: 180 ul de 50 mg / ml solution de pentobarbital sodique, 100 uL d'éthanol absolu, 320 ul de 65 mg / ml de sulfate de magnésium aqueuse (module tonus utérin), et 400 ul de propylène glycol (miscible véhicule avec aqueuse et organique composants).
  2. Évaluer l'exhaustivité de l'anesthésie en effectuant des tests de stimuli nocifs: squeeze patte; réponse et un clin d'tactile joue et vibrisses; pincement de la queue. Appliquer une pommade ophtalmique stérile pour les cornées.
  3. Rasez la fourrure abdominale de la zone sus-pubienne à la cage thoracique avec des ciseaux et une lame fine (Oster n ° 40 de la lame). Désinfecter l'abdomen avec de l'éthanol 70%, povidone iodée 10% (Bétadine), une éthanol 70%, de manière séquentielle. Placer la souris l'abdomen vers le bas sur un champ stérile et puis définissez sur un coussin chauffant ou une assiette chaude (37 ° C) pendant 2-5 minutes.
  4. Incisez la peau de l'abdomen sur la ligne médiane ventrale avec le ballon-ciseaux à bouts. Elargir l'incision pour 10-14 mm. Identifier la ligne blanche, un avasculaire, bande blanche du tissu conjonctif le long de la ligne médiane ventrale de la paroi abdominale. Incisez la ligne blanche avec boule ciseaux à bouts et d'étendre l'incision 10-14 mm. Rincer immédiatement l'abdomen avec préchauffé (37 ° C) solution de Ringer lactate.
  5. Externaliser les deux cornes de l'utérus avec une pince à anneaux, sans appliquer une pression excessive sur les sites d'implantation. Irriguer les cornes utérines externalisés avec préchauffé, solution de Ringer lactate.

2. Microinjection transutérine

  1. Fabriquer une paroi épaisse, une pipette capillaire en verre borosilicate microinjection avec les caractéristiques suivantes: 12-16 μm diamètre extérieur et un biseau de 20 degrés. Sur un extracteur Sutter P-97 de la pipette avec filament petite boîte, utiliser le programme suivant: test de rampe de chaleur = plus de 3 unités; pression = 200; tirez = 0; vitesse = 46; temps = 100). Avec le Sutter BV-10 chanfreiner, utilisez la 104C (d'or) disque abrasif pour les pipettes de grand diamètre. Expression Resuspendre plasmide à pg 3-4 / uL dans le phosphate de calcium libre une solution saline tamponnée (pH 7.2-7.4). Ajouter cristallin vert rapide à l'ADN, tourbillon concentré doucement pendant 30 secondes, et tourner à 10.000 g pendant 10 secondes. Le montant minimum de vert rapide nécessaire de suivre visuellement l'efficacité de l'injection est déterminé de manière empirique. Remblayer la pipette biseauté avec l'ADN / solution rapide vert. Connecter le pipette micro-injection chargé au support de pipette de la pression (Picospritzer utilisant> 99% d'azote pur comme gaz de source) d'injecteur.
  2. Transilluminez l'utérus avec une faible intensité, la lumière halogène pour visualiser l'embryon au sein de son site d'implantation. Identifier le BEATing coeur, du cerveau, les bourgeons des vésicules des membres, naissante 4 e ventricule du cerveau postérieur et les yeux. Irriguer l'utérus toutes les 2 minutes avec préchauffé, de solution de Ringer lactate pour maintenir l'hydratation. Appliquez une légère pression sur l'utérus pour réorienter l'embryon et d'identifier les repères anatomiques indiqué ci-dessus.
  3. Orient l'embryon afin d'identifier la veine primaire dont la tête antérieure et postérieure flanc branches sur le territoire mésenchymateuse dans lequel le otocyst réside. Le otocyst adéquate ne peut être vu par transillumination de l'utérus. Le otocyst est situé à mi-chemin entre les branches antérieure et postérieure de la veine tête primaire qui, avec le tronc principal de la veine, former la forme des montants ou des montants de but sur un terrain de football américain. Le otocyst est à mi-chemin entre les montants.
  4. Insérer la pipette d'injection dans l'utérus dans une trajectoire en ligne avec l'emplacement présumé de l'otocyst. Impulsions de micro-injecteur l'une fois après avoir traversé le uterde visualiser le colorant marqueur et le approximative l'emplacement de la pointe de pipette. Avancez la pipette sous le contrôle de micromètre et pulser à nouveau pour évaluer la profondeur. Faire progresser la pipette dans le mésenchyme latérale de la tête et le pouls à plusieurs reprises. Ciblage otocyst réussie permettra de connaître la forme conique du conduit endolymphatique dorsalement et le pétoncle shell-forme du vestibule. Relâcher la pression sur l'utérus, retirer la pipette de l'embryon / utérus en un seul mouvement, et immédiatement irriguer l'utérus avec préchauffé, solution de Ringer lactate.

3. Électroporation in vivo

  1. Irriguer l'utérus avec une solution de Ringer lactate de. Solution fraîchement appliqué Ringer lactate est nécessaire pour coupler électriquement les électrodes à aubes de style à l'utérus. Humidifier les surfaces de tungstène des électrodes avec de Ringer lactate. Centre l'otocyst injecté dans le trajet des électrodes. Compresser doucement l'utérus avec le pa électroporationddles. La cathode est en contact avec la paroi utérine en dehors de la otocyst injecté et l'anode est en contact avec la paroi utérine adjacente à la otocyst non-injecté. Déclencher un train d'impulsions d'ondes carrées avec le commutateur pédale sur le électroporateur. Paramètres d'électroporation sont les suivants: 5, 50 ms à 43 volts impulsions par impulsion et de 950 ms d'interruption d'retard. Rincer immédiatement l'utérus après le train d'impulsions est livré. Enregistrez le courant délivré au tissu: 60-100 mAmps est suffisante pour transfecter otiques progéniteurs épithéliaux. Injecter et électroporer 4-6, les embryons E11.5 par barrage.
  2. Effectuer une seconde, la micro-injection d'une solution aqueuse indépendante transutérine fluorescente dextrane (Alexa Fluor 488 si le plasmide d'expression codant pour une protéine fluorescente rouge ou Alex Fluor 594 si le plasmide d'expression codant pour une protéine fluorescente verte) dans le ventricule 4 ème de ces embryons intérieure duquel sont oreilles précision injecté et au moins 60 mAmps de courant par impulsion était delivered pendant électroporation. Le dextran fluorescent sera détectable à la naissance dans le cerveau postérieur et permettre la sélection des chiots dont les oreilles ont été manipulés intérieure cours de l'embryogenèse (voir 3.5).
  3. Irriguer les cornes utérines avec de Ringer lactate. Réinsérez les cornes utérines dans la cavité abdominale. Rincer la cavité utérine avec 2-4 ml de préchauffée, solution de Ringer lactate et de permettre le débordement de s'écouler du site d'incision sur le champ stérile. Remplacer le drapage à sec, du matériel stérile. Suturer la paroi abdominale avec une aiguille non-coupe et une suture résorbable 6-0. Nous préférons un point en cours d'exécution, chaque point de blocage d'autres, à la fois pour la paroi abdominale et la peau.
  4. Séchez la fourrure des barrages et d'administrer des non-stéroïdiens anti-inflammatoires tels que le méloxicam par injection sous-cutanée. Retour du barrage à la cage de récupération préchauffé sur un champ stérile. Surveiller et enregistrer la respiration des barrages, la perméabilité du site d'incision et le vagin pour la décharge sanglante. Le saignement est rare, mais si elle est présente et sans relâche, euthanasier le barrage alors qu'elle est encore sous anesthésie. Notez le temps qu'elle reprenne conscience et tente de se déplacer. Retour du barrage de la colonie de souris quand elle montre des signes de manger et de boire et a commencé à construire le nid. Typiquement, cela se produit dans les 12 heures.
  5. À la naissance (jour postnatal 0), le flash de la région du cerveau postérieur de chaque chiot dans la litière pour détecter la fluorescence de dextrane en utilisant un microscope à dissection avec un stereofluorescence GFP ou le Texas Red jeu de filtres, le cas échéant. Retour au barrage en lactation seulement les chiots qui affichent étiquetage rhombencéphale.

4. Les résultats représentatifs

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Figure 1. Le transfert de gènes à médiation électroporation de la cochlée de développement. Le otocyst E11.5 a été injecté avec une expression accrue de codage plasmide protéine fluorescente verte (EGFP) et électroporé (TRA d'impulsionsdans les paramètres: cinq, 43 impulsions volts à 50 ms / impulsion et 950 msec d'interruption d'attente). A) représentant l'oreille intérieure à partir d'un jour après la naissance 6 (P6) dont la chiot otocyst a été injecté et une électroporation à E11.5 démontrant l'expression EGFP de la base à travers la spire médiane de la cochlée. La paroi latérale de la cochlée a été retiré de la spire médiane et le sommet seulement. Progéniteurs E11.5 qui donnent lieu à l'apex n'ont pas été transfectées. B) de montage entier immunocoloration de la cochlée à (A) avec le marqueur de cellules ciliées, 7a myosine (Myo7a), indique que l'expression EGFP suit la trajectoire de l'organe de Corti et est grossièrement localisée sur les cheveux cellule-palier épithélium sensoriel. C) Une oreille intérieure représentant d'un embryon dont E18.5 otocyst a été injecté et une électroporation à E11.5. La projection laser confocal montre expression de l'EGFP dans Myo7a-positifs cellules ciliées sensorielles. D) Laser de projection confocale de l'épithélium sensoriel cochléaire de l'organe de Corti E18.5 indiquant EGFP expression dans les cellules ciliées internes (IHC), les cellules ciliées externes (OHC), les intérieurs des cellules phalangial (IPC), les cellules pilier (PC), et les cellules de Deiters (dc). La barre d'échelle en (B) s'applique à (A).

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Discussion

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Le transfert de gènes à l'oreille de souris en développement interne: L'oreille de la souris intérieure se développe à partir de la placode otique pendant la première semaine du développement post-implantation 12,13. Par jour embryonnaire 9.5 (E9.5), la placode a invaginé et transformé en une vésicule remplie de liquide appelé le otocyst 2. Précurseurs otiques dans la vésicule donner lieu à des cellules sensorielles et non sensorielles au sein de l'oreille interne matures ainsi que...

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Déclarations de divulgation

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Pas de conflits d'intérêt déclarés.

Remerciements

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Nous tenons à remercier la presse pour Humana la permission de publier le chiffre de fabrication de micro-injection pipette qui a été publié à la page 130 de la référence 11; Larry Dlugas et Steven Wong, OHSU ministère des Communications pour l'éducation, pour la vidéographie; Larry Dlugas pour la conception et le montage vidéo; Adam M. O »Quinn, Senior Designer, Trion / Envirco pour la conception de notre coutume hotte à flux laminaire horizontal et Les Goldsmith pour fournir le schéma technique; Victor Monterroso, MV, MS, PhD et Tom Chatkupt, DVM, OHSU département de médecine comparée, pour obtenir des conseils avec notre protocole de soins des animaux, des techniques chirurgicales, et prophylactiques analgésie régime; Marcel Perret-Gentil, DVM, MS, pour le partage de son document sur les techniques de suture vétérinaires; Edward Porsov, MS, pour la conception de notre Adobe Premiere Pro vidéo microscopie poste de travail informatique, et Leah White et Jonas Hinckley du LNS sous-titrage (Portland, OR). Ce travail a été soutenu par des subventions de l'Institut national sur la surdité et d'Other troubles de la communication: DC et DC R01 008595 008595 R01-04S2 (à JB) et P30 DC005983 (Oregon audience Centre de recherche de base Grant, Peter Gillespie, chercheur principal).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Nom du réactif Entreprise Numéro de catalogue Commentaires
Micro Case stérilisation Roboz RS-9900A 8X8.5X1.25 pouces
Ball-ciseaux à bouts Outils belle science 14109-09
Pince à anneaux Outils belle science 11106-09 4.8mm ID/6mm OD
Pince Adson tissus Outils belle science 11027-12
Pilote aiguille Outils belle science 12502-12
Plateau seringue allergie Becton Dickison 305536
Suture 6-0 Syneture GL-889 0,7 suture métrique gastro-intestinal
Lactate de Ringer pour injection USP Baxter 2B2323
Vert rapide Sigma-Aldrich F7258
Le verre borosilicate capillaire Harvard Apparatus 30-0053
Solution de sodium Nembutal OVATION Pharmaceuticals Inc NDC 67386-501-52
MgSO4.7H2O Fisher Scientific M63-500
Propylène glycol Fisher Scientific P355-1
L'éthanol Sigma-Aldrich E7023-500
Le méloxicam Boehringer Ingeheim NADA 141-219
Micropipette Puller Sutter Instruments P-97 Filament boîte de FB255B, consulter Cookbook pipette d'instruments Sutter
Chanfreiner microélectrode Sutter Instruments BV-10 Disque biseautage 104C pour les pipettes de grande taille; consulter le manuel du propriétaire pour biseauter la théorie
Titulaire Micropipette Warner Instruments MP-S15T Pour pipette 1,5 mm de diamètre externe et le port de pression femelle pour tube Picospritzer.
Pince à épiler style électrode Protech International Inc CUY650P5 5 mm de diamètre externe
Place Vague Electroporateur Protech International Inc CUY21EDIT Pédale recommandée
PICOSPRITZER III Parker Hannifin 051-0500-900 Pédale recommandée
Micromanipulateur commande manuelle Harvard Apparatus 640056
Horizontal banc à flux laminaire propre Envirco Des modifications personnalisées au 630-10554 LF. Voir les informations complémentaires pour schématique capot.
Leica stereofluorescence dissection microcope avec Lumencor SOLA lumière de moteur de Bartels et Stout et Lumencor MZ10F avec Lumencor SOLA lumière de moteur de Pédales d'axer le MZ10F et de déclencher le moteur de lumière SOLA sont recommandés
Alexa Fluor 594 Dextran Invitrogen D22913 10mg/ml, aqueuse
Alexa Fluor 488 Dextran Invitrogen D22910 10mg/ml, aqueuse
Enviro-dri Shepherd spécialité PapERS www.ssponline.com

Références

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Mots-clés

Laparotomie ventralemicro injection transut rineinjection dans la v sicule otiquejour embryonnaire 115technique de transfert de g neslectrodes palettesanalyse de l expression de la GFPprotocole de soins animaliers

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