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Article de méthode

Utilisation de l'interféron γ-enzymatique de dosage immunoenzymatique pour caractériser les nouveaux épitopes de lymphocytes T de virus du papillome humain

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DOI :

10.3791/3657

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8 mars 2012

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1Department of Microbiology and Parasitology, College of Basic Medical Sciences, China Medical University , 2Department of Obstetrics and Gynecology, College of Medicine, University of Arkansas for Medical Sciences , 3Department of Pathology, College of Medicine, University of Arkansas for Medical Sciences

Dans cet article

Résumé

La caractérisation des épitopes T des agents pathogènes responsables d'infections localisées, comme le papillomavirus humain, représente un défi en raison du nombre limité de lymphocytes T en circulation. Une méthode est décrite, permettant l'isolement et la caractérisation de lymphocytes T rares à partir d'un très faible nombre de cellules.

Résumé

Un protocole a été mis au point pour surmonter les difficultés liées à l'isolement et à la caractérisation de rares lymphocytes T spécifiques de pathogènes, tels que le papillomavirus humain (HPV), responsables d'infections localisées. Les étapes impliquées consistent à identifier la ou les régions des protéines du HPV contenant un ou plusieurs épitopes pour les lymphocytes T chez un sujet donné, à sélectionner les lymphocytes T spécifiques des peptides en se basant sur la sécrétion d'interféron-γ (IFN-γ), puis à cultiver et caractériser les clones de lymphocytes T (Fig. 1). Le sujet 1 était un patient récemment diagnostiqué avec une lésion intraépithéliale squameuse de haut grade par biopsie et ayant subi une conisation par boucle diathermique le jour même du prélèvement des lymphocytes T1. Une région des protéines E6 et E7 du papillomavirus humain de type 16 (HPV 16) contenant un épitope pour les lymphocytes T a été identifiée à l’aide d’un test ELISPOT (enzyme-linked immunospot) mesurant l’IFN-γ, réalisé avec des peptides synthétiques chevauchants (Fig. 2). Les données de ce test ont permis non seulement d’identifier une région contenant un épitope pour les lymphocytes T, mais aussi d’estimer le nombre de lymphocytes T spécifiques de cet épitope et de les isoler en fonction de leur sécrétion d’IFN-γ, à l’aide de billes magnétiques commerciales (kit d’isolement des lymphocytes T CD8, Miltenyi Biotec, Auburn CA). Les lymphocytes T sécrétant l’IFN-γ sélectionnés ont été dilués et cultivés individuellement en présence d’un mélange de cellules nourricières irradiées afin de favoriser la croissance d’un seul lymphocyte T par puits. Ces clones de lymphocytes T ont été criblés à l’aide d’un test ELISPOT mesurant l’IFN-γ, en présence de peptides recouvrant la région identifiée et de cellules B lymphoblastoïdes autologues transformées par le virus d’Epstein-Barr (LCLs, obtenues comme décrit par Walls et Crawford)2, afin de réduire au minimum le nombre de cellules nécessaires par clone. Plutôt que d’utiliser les 1 x 105 cellules par puits habituellement employées dans les tests ELISPOT1,3, seulement 1 000 cellules du clone de lymphocytes T en présence de 1 x 105 LCLs autologues ont été utilisées, réduisant ainsi de façon spectaculaire le nombre de cellules requises. Les LCLs autologues ont servi non seulement à présenter les antigènes peptidiques aux cellules du clone de lymphocytes T, mais aussi à maintenir une densité cellulaire élevée dans les puits, permettant aux cellules du clone spécifiques de l’épitope de sécréter l’IFN-γ. Ceci garantit la réussite du test ELISPOT mesurant l’IFN-γ. De manière similaire, des tests ELISPOT mesurant l’IFN-γ ont été utilisés pour caractériser la séquence peptidique minimale et optimale de l’épitope pour les lymphocytes T CD8 (HPV 16 E6 52-61 FAFRDLCIVY) ainsi que son élément de restriction de classe I du CMH (B58). Le test ELISPOT mesurant l’IFN-γ a également été réalisé en utilisant des LCLs autologues infectées par un virus vaccinia exprimant la protéine E6 ou E7 du HPV 16. Le résultat a démontré que l’épitope T du E6 était traité de façon endogène. La reconnaissance croisée de l’épitope T homologue d’autres types de HPV à haut risque a été mise en évidence. Cette méthode peut également être utilisée pour décrire des épitopes pour les lymphocytes T CD44.

Protocole

En réalisant un dosage ELISPOT de l'IFN-γ avec une lignée de cellules T CD8 établie à partir du sujet 1, on a déterminé que la région HPV 16 E6 46-70 contenait un épitope pour les cellules T1 (Fig. 2), et les cellules T spécifiques de cet épitope ont été sélectionnées en fonction de leur sécrétion d'IFN-γ avant le début de ce protocole (Fig. 1).

1. Dilution limitante de lymphocytes T spécifiques d'épitope

  1. Préparez le mélange de cellules nourricières en combinant des cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC) allogéniques irradiées (4 000 rad) à 5 x 105 cellules/ml, des lignées cellulaires lymphoblastoïdes (LCL) allogéniques irradiées (5 000 rad) à 5 x 104 cellules/ml et de la phytohémagglutinine (PHA) à 0,1 μg/ml dans un milieu Yssel complet contenant 1 % de sérum humain poolé. Manipulez les cellules en conditions stériles tout au long du protocole.
  2. Effectuez une dilution en série des lymphocytes T spécifiques de l'épitope isolés (Fig. 3) à l’aide du mélange de cellules nourricières jusqu’à une concentration de 0,5 cellule/100 μl ou 5 cellules/1 ml. Utilisez environ 3 x 103 lymphocytes T spécifiques de l'épitope.
  3. Répartissez 100 μl/puits de lymphocytes T spécifiques de l'épitope dilués dans un total de 30 à 60 plaques de 96 puits à fond rond à l’aide d’une pipette multicanal.
  4. Incubez les plaques dans une étuve à 37 °C, 5 % CO2.
  5. Au jour 5, ajoutez 100 μl de milieu Yssel complet contenant 20 u/ml d’interleukine-2 humaine recombinante (rhIL-2).
  6. Identifiez visuellement les clones de lymphocytes T en prolifération dans les plaques de 96 puits à fond rond en fonction de la taille importante de leurs culots au fond des puits.
  7. Aux jours 11 à 14, préparez un nouveau mélange de cellules nourricières en combinant des PBMC allogéniques irradiées (4 000 rad) à 1 x 106 cellules/ml, des LCL allogéniques irradiées (5 000 rad) à 1 x 105 cellules/ml et de la PHA à 0,1 μg/ml dans un milieu Yssel complet. Répartissez ce nouveau mélange de cellules nourricières dans une plaque de 24 puits à raison de 1 ml/puits.
  8. Aspirez individuellement les clones de lymphocytes T de chaque puits à l’aide d’une micropipette pouvant contenir environ 200 μl de volume.
  9. Distribuez individuellement les clones de lymphocytes T dans la plaque de 24 puits contenant le nouveau mélange de cellules nourricières. Répétez jusqu’à ce que tous les clones de lymphocytes T aient été transférés.

2. Identification de clones de lymphocytes T spécifiques d'épitopes à l'aide d'un dosage ELISPOT à haut débit (adapté d'une méthode décrite par Larsson et al.5)

  1. Recouvrir 2 plaques stériles pour ELISPOT (Multiscreen-HA ; Millipore, Bedford, MA) avec 50 μl/puits d'anticorps monoclonal primaire anti-IFN-γ (clone D1K, Mabtech, Stockholm, Suède) dilué à 5 μg/ml dans du tampon phosphate salin stérile de qualité pour culture cellulaire (PBS) pendant au moins 1 heure à 4 °C.
  2. Laver les puits avec 150 à 200 μl/puits de PBS en versant et en éliminant. Répéter trois fois supplémentaires.
  3. Bloquer la liaison non spécifique en ajoutant 50 μl/puits de sérum humain poolé dilué à 5 % dans le RPMI 1640 pendant au moins 1 heure à 37 °C, 5 % CO2. Éliminer les grosses bulles en les perçant avec une aiguille stérile.
  4. Ensemencer 1 x 105 LCL autologues2 dans 50 μl de RPMI 1640 contenant 5 % de sérum humain par puits.
  5. Mélanger les cellules dans chaque puits de la plaque 24 puits contenant les clones de lymphocytes T à l’aide d’une pipette de 1 ml. Transférer 100 μl par puits dans un tube Eppendorf stérile. Ajouter 500 μl de RPMI 1640 avec 5 % de sérum humain poolé à chaque tube Eppendorf, puis centrifuger dans une microcentrifugeuse à 3 000 tr/min pendant 5 min.
  6. Éliminer le surnageant des tubes Eppendorf, ajouter 110 μl de RPMI 1640 avec 5 % de sérum humain par tube, puis resuspendre les cellules à l’aide d’un vortex.
  7. Ensemencer 50 μl de milieu contenant un clone spécifique de lymphocytes T, indépendamment du nombre de cellules, dans des puits identiquement positionnés des 2 plaques, pour un criblage rapide. Répéter pour tous les clones de lymphocytes T. En supprimant les étapes de comptage cellulaire, un grand nombre de clones de lymphocytes T peut être testé simultanément.
  8. Combiner le milieu restant provenant de plusieurs tubes Eppendorf, puis ensemencer 50 μl dans les puits suivants identiquement positionnés, qui serviront de puits de contrôle positif auxquels sera ajouté le PHA.
  9. Ajouter 50 μl de RPMI 1640 avec 5 % de sérum humain poolé à chaque puits qui servira de puits de contrôle négatif, ne contenant pas de clones de lymphocytes T.
  10. Ajouter les peptides contenus dans la région positive (Tableau 1) à raison de 50 μl/puits pour une concentration finale de 10 μM/peptide. Les stocks de peptides sont dissous à 5 mM chacun dans 5 % à 15 % de diméthylsulfoxyde dans du PBS, selon la solubilité des peptides. Chaque puits contiendra un volume total de 200 μl (50 μl de solution de blocage, 50 μl de LCL, 50 μl de clones de lymphocytes T et 50 μl de peptides).
  11. Ajouter 50 μl de PHA (concentration finale de 10 μg/ml) aux puits de contrôle positif.
  12. Ajouter 50 μl de RPMI 1640 avec 5 % de sérum humain poolé aux puits de contrôle négatif.
  13. Incuber toute la nuit à 37 °C, 5 % CO2.
  14. Laver les puits avec 150 à 200 μl/puits de PBS contenant 0,05 % de Tween-20 en versant et en éliminant. Répéter trois fois supplémentaires.
  15. Ajouter 50 μl de PBS contenant 1 μg/ml d’anticorps monoclonal anti-IFN-γ marqué à la biotine (clone 7B-6, Mabtech), puis incuber à 37 °C, 5 % CO2 pendant 2 heures. Éliminer les grosses bulles en les perçant avec une aiguille.
  16. Vingt minutes avant la fin de l’incubation de 2 heures, préparer le réactif d’avidine liant la biotine conjuguée à la peroxydase de raifort H (kit Vectastain Elite ABC ; Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA) en ajoutant 2 gouttes de solution A et 2 gouttes de solution B à 5 ml de PBS contenant 0,1 % de Tween-20.
  17. Laver les puits avec 150 à 200 μl/puits de PBS contenant 0,1 % de Tween-20 en versant et en éliminant. Répéter trois fois supplémentaires.
  18. Ensemencer 50 μl/puits de peroxydase de raifort biotinylée H, puis incuber à 37 °C, 5 % CO2 pendant 1 heure. Éliminer les grosses bulles en les perçant avec une aiguille.
  19. Laver les puits avec 150 à 200 μl/puits de PBS contenant 0,1 % de Tween-20 en versant et en éliminant. Répéter trois fois supplémentaires.
  20. Ensemencer 50 μl/puits d’un réactif colorant appelé diaminobenzidine (DAB) stable, à température ambiante pendant 5 minutes. Éliminer les grosses bulles en les perçant avec une aiguille.
  21. Laver les puits avec 150 à 200 μl/puits d’eau déionisée en versant et en éliminant. Répéter deux fois supplémentaires.
  22. Laisser la plaque sécher complètement.
  23. Compter les taches à l’aide d’un microscope stéréoscopique ou d’un lecteur automatisé d’ELISPOT (AID ELISPOT Classic Reader ; Autoimmun Diagnostika GmbH, Strassberg, Allemagne).

3. Confirmation de la nature spécifique de l'épitope des clones de lymphocytes T à l'aide d'un test ELISPOT (Figure 4)

  1. Sélectionnez des clones de lymphocytes T en bonne croissance. Réalisez un dosage ELISPOT comme décrit ci-dessus, sauf que 1 x 105 LCL autologues et 1 x 103 cellules par clone de lymphocytes T seront mis en culture par puits, en présence de chacun des trois peptides contenus dans la région (Tableau 1) à 10 μM. Mettez en place le dosage en double ou en triple exemplaire.

4. Déterminer si l'épitope est traité de manière endogène (Fig. 5)

  1. Sélectionner des clones de lymphocytes T en bonne croissance. Réaliser un dosage ELISPOT comme décrit précédemment, sauf que 1 x 105 LCL autologues infectées par un virus vaccinal recombinant exprimant E6 et E7 du VPH 16 6 (avant le dosage) ou non (souche sauvage, souche WR) (multiplicité d'infection de 5 pendant 1 heure) ainsi que 1 x 103 cellules par clone de lymphocytes T par puits seront ensemencées.

5. Caractérisation de la séquence minimale et optimale de l'épitope T (Fig. 6a, 6b et 6c)

  1. Sélectionner des clones de lymphocytes T en bonne croissance. Réaliser un test ELISPOT comme décrit ci-dessus, sauf que 1 x 105 LCL autologues et 1 x 103 cellules de clone de lymphocytes T par puits seront mis en culture avec l'un des peptides recouvrants de 9 acides aminés couvrant la région (Tableau 1) à 10 μM (Fig. 6a).
  2. Réaliser un test ELISPOT comme décrit ci-dessus, sauf que 1 x 105 LCL autologues et 1 x 103 cellules de clone de lymphocytes T par puits seront mis en culture avec l'un des peptides de longueurs variables (Tableau 1) à 10 μM (Fig. 6b).
  3. Réaliser un test ELISPOT comme décrit ci-dessus, sauf que 1 x 105 LCL autologues et 1 x 103 cellules de clone de lymphocytes T par puits seront mis en culture avec quelques peptides les plus susceptibles de contenir la séquence minimale et optimale d'acides aminés. Ces peptides seront testés à des concentrations allant de 10-5 M à 10-10 M (Fig. 6c).

6. Identification de l'élément de restriction à l'aide du test ELISPOT (Figure 7)

  1. Sélectionnez des clones de lymphocytes T en bonne croissance. Réalisez un test ELISPOT comme décrit ci-dessus, sauf que 1 x 103 cellules par puits du clone de lymphocytes T seront ensemencées avec le peptide minimal et optimal à 10 μM. Cent mille LCL allogéniques par puits partageant une ou deux molécules HLA de classe I avec le sujet étudié seront également ensemencés.

7. Étude de la réactivité croisée des clones de lymphocytes T spécifiques d'épitopes avec des séquences d'acides aminés homologues provenant d'autres types de VPH à haut risque (Fig. 8)

  1. Sélectionnez des clones de lymphocytes T en bonne croissance. Réalisez un dosage ELISPOT comme décrit ci-dessus, sauf que 1 x 103 cellules par puits de clone de lymphocytes T seront ensemencées avec des peptides (10 μM) contenant des séquences d'acides aminés homologues provenant d'autres types de VPH à haut risque (Tableau 2). Cent mille LCL autologues par puits ainsi que des LCL allogéniques exprimant les molécules de classe I HLA restrictives seront également ensemencés dans des puits respectifs.

8. Résultats représentatifs

Le sujet 1 présenté ici était une femme afro-américaine âgée de 22 ans, ayant récemment reçu un diagnostic de lésion intraépithéliale squameuse de haut grade par biopsie. Elle s'est présentée pour un traitement par conisation électrique au jour de la collecte des lymphocytes T1. Le test ELISPOT de sa lignée de lymphocytes T CD8 a montré que la région HPV 16 E6 46-70 (chaque région étant testée avec trois peptides recouvrants de 15 acides aminés) contenait un épitope T-cellulaire (Fig. 2). Le nombre de lymphocytes T spécifiques de l'épitope sélectionnés sur la base de la sécrétion d'IFN-γ était de 1,2 × 105. Après avoir effectué une dilution limitante (Fig. 3) sur un cinquième des cellules sélectionnées, 262 clones de lymphocytes T ont été récoltés. Les cellules sélectionnées restantes n'ont pas été utilisées, car la première tentative de clonage des lymphocytes T a été couronnée de succès. Le test ELISPOT à haut débit réalisé sur 94 de ces clones a identifié 62 clones positifs au criblage, facilement visibles macroscopiquement sur la plaque ELISPOT. Les clones restants n'ont pas été testés, puisque le premier test ELISPOT avait déjà identifié des clones de lymphocytes T spécifiques du peptide. Huit clones positifs au criblage et présentant une bonne croissance ont été retestés individuellement avec les trois peptides de 15 acides aminés couvrant la région (Fig. 4). Tous les clones de lymphocytes T ont réagi positivement aux peptides HPV 16 E6 51-65, 6 des 8 clones ont réagi positivement au peptide E6 46-60, et aucun clone n'a réagi au peptide E6 56-70. Des tests réalisés avec des LCL autologues infectés par un virus vaccinia recombinant exprimant la protéine E6 ou E7 du HPV 16 ont démontré que les clones de lymphocytes T reconnaissent un épitope E6 endogènement traité (Fig. 5). Des tests avec une série de peptides recouvrants de 9 acides aminés couvrant la région HPV 16 46-65 (Tableau 1) ont montré la meilleure réponse avec le peptide E6 53-61 (Fig. 6a). Les deux peptides de 10 acides aminés contenant le peptide E6 53-61, les deux peptides de 8 acides aminés inclus dans le peptide E6 53-61, ainsi qu’un peptide de 11 acides aminés contenant les deux peptides de 10 acides aminés ont été testés, et le peptide E6 52-61 (10-mer) s'est révélé être la séquence minimale et optimale de façon la plus constante (Fig. 6b). Toutefois, le peptide E6 53-61 (9-mer) a induit une réponse tout aussi forte avec le clone de lymphocytes T n°79. Ce clone a été testé avec ces deux peptides sur une gamme plus large de concentrations, et le peptide E6 52-61 (10-mer) a conservé la positivité bien plus efficacement que le peptide E6 53-61 (9-mer) à des concentrations plus faibles de peptide (Fig. 6c). Le peptide plus long E6 52-62 (11-mer) n’a pas été testé, car l’objectif était de définir la séquence la plus courte induisant une réponse robuste. Le peptide E6 52-61 (10-mer) a été identifié comme contenant la séquence minimale et optimale.

La molécule HLA de classe I restreinte de l'épitope T CD8 peut être analysée à l'aide d'un test ELISPOT utilisant des LCL allogéniques exprimant une ou deux molécules HLA de classe I communes avec le sujet. Toutefois, les résultats ont été non concluants pour le sujet 1 en raison d'un fort bruit de fond observé dans le test ELISPOT. La molécule HLA de classe I restreinte pour le sujet 1 a ensuite été identifiée comme étant B58 à l'aide d'un test de libération de chrome (données non montrées). Fig. 7 présente un exemple provenant d'un autre sujet [sujet A, chez qui on a observé la détection de la séquence minimale et optimale E6 75-83 (KFYSKISEY), comme décrit par Wang et al.]7. Une forte positivité est observée avec un LCL exprimant les molécules B62 et Cw3, tandis qu'une positivité de fond est observée avec un LCL exprimant Cw3. Un test de libération de chrome a confirmé que la molécule B62 était l'élément restreint pour le sujet A7.

Certaines régions du génome du VPH sont fortement conservées, et des séquences homologues aux régions E6 52-61 du VPH 16 étaient présentes dans 13 autres types de VPH à haut risque (Tableau 2). Une forte reconnaissance croisée (>50 % des unités formant des taches pour le peptide E6 52-61 du VPH 16) a été démontrée pour 8 des 13 types de VPH à haut risque (Fig. 8).

Organigramme d'identification des épitopes T par dosage ELISPOT ; les étapes comprennent l'isolement et l'analyse.
Figure 1. Schéma général décrivant la série d'expériences permettant de caractériser de nouveaux épitopes T. Cet article décrit le protocole à partir de la troisième case en partant du haut.

Graphique en barres de la réponse immunitaire, unités formant des colonies par rapport aux régions peptidiques, pic dominant observé pour E6.
Figure 2. Un test ELISPOT réalisé afin d'identifier la (ou les) région(s) contenant l'épitope pour les lymphocytes T. Cent mille lymphocytes T CD8 stimulés in vitro par puits ont été mis en culture avec trois peptides recouvrants de 15 acides aminés (10 μM chacun), couvrant chaque région des protéines E6 et E7 du VPH 16. Cet exemple provenant du sujet 1 a montré la présence d'un épitope pour les lymphocytes T dans la région E6 46-70. Les barres représentent les erreurs standards des moyennes.

Schéma du processus de dilution en culture cellulaire, dilution étape par étape pour obtenir 0,5 cellule par puits.
Figure 3. Schéma illustrant la dilution de cellules T spécifiques d'un épitope à l'aide d'un mélange de cellules nourricières jusqu'à une concentration de 0,5 cellule par puits.

Histogramme des unités formant des taches par clone ; comparaison des peptides PHA, E6 46-60, E6 51-65, E6 56-70.
Figure 4. Un test ELISPOT réalisé afin d'identifier les sous-régions contenant l'épitope pour les lymphocytes T en testant individuellement les trois peptides de 15 acides aminés. Cet exemple provenant du Sujet 1 a montré la présence de l'épitope dans les sous-régions E6 46-60 et E6 51-65. Les barres représentent les erreurs standards des moyennes.

Histogramme, unités formant des taches par puits ; clones n° 5-79 ; tests PHA, E6-Vac, E7-Vac, WR ; réponse immunitaire.
Figure 5. Un test ELISPOT réalisé afin d'examiner si l'épitope des lymphocytes T est présenté de manière endogène. Cet exemple provenant du sujet 1 a révélé que les clones de lymphocytes T reconnaissaient un épitope E6 traité de manière endogène. Les barres représentent les erreurs standards des moyennes.

Graphique des unités formant des colonies analysant la réponse aux peptides ; inclut des diagrammes en barres et des courbes avec les données des clones.

Figure 6. Des dosages ELISPOT réalisés pour caractériser la séquence peptidique minimale et optimale de l'épitope T-cellulaire. Les mêmes clones ont été utilisés chaque fois que possible. (a) Un dosage ELISPOT réalisé à l'aide de peptides recouvrants de 9 acides aminés. Cet exemple provenant du sujet 1 a révélé que l'épitope se situe dans la sous-région E6 53-61. (b) Un dosage ELISPOT réalisé afin d'identifier la séquence peptidique minimale et optimale, en utilisant des peptides de longueurs variables. Cet exemple a montré que la séquence peptidique la plus courte et optimale était le plus souvent le peptide E6 52-61, suivi par le peptide E6 53-61. (c) Un dosage ELISPOT réalisé pour confirmer quel peptide contient la séquence minimale et optimale. Le peptide E6 52-61 a conservé une réponse positive à des concentrations plus faibles et a été déterminé comme étant la séquence minimale et optimale. Les barres représentent les erreurs standards de la moyenne.

Histogramme du nombre d'unités formant des colonies de lymphocytes par clone, comparant les LCL autologues et allogéniques appariés.


Figure 7. Un test ELISPOT réalisé afin d'identifier la molécule HLA de classe I restrictrice. Cet exemple appuie l'hypothèse selon laquelle la molécule B62 est l'élément de restriction pour le clone de lymphocytes T CD8 du sujet A reconnaissant l'épitope HPV 16 E6 75-837. Ceci a été confirmé par un test de libération de chrome. Les barres représentent les erreurs standards des moyennes.

Graphique en barres de la réponse immunitaire au VPH ; unités formant des foyers par puits ; comparaison LCL autologue/allogénique.
Figure 8. Un test ELISPOT réalisé pour évaluer la réactivité croisée des clones de lymphocytes T spécifiques de la séquence 52-61 du VPH 16 envers des séquences similaires provenant d'autres types de VPH à haut risque (Tableau 2). Cet exemple provenant du Sujet 1 a montré une réactivité croisée importante (>50 % de positivité par rapport au VPH 16 52-61) pour 8 des 13 autres types de VPH à haut risque examinés. Les barres représentent les erreurs standards des moyennes.

Type de VPHRésidus AA*Séquence^
16E6 46-60 (15)RREVYDFAFRDLCIV
16E6 51-65 (15)DFAFRDLCIVYRDGN
16E6 56-70 (15)DLCIVYRDGNPYAVC
16E6 52-62 (11)FAFRDLCIVYR
16E6 52-61 (10)FAFRDLCIVY
16E6 53-62 (10)AFRDLCIVYR
16E6 46-54 (9)RREVYDFAF
16E6 47-55 (9)REVYDFAFR
16E6 48-56 (9)EVYDFAFRD
16E6 49-57 (9)VYDFAFRDL
16E6 50-58 (9)YDFAFRDLC
16E6 51-59 (9)DFAFRDLCI
16E6 52-60 (9)FAFRDLCIV
16E6 53-61 (9)AFRDLCIVY
16E6 54-62 (9)FRDLCIVYR
16E6 55-63 (9)RDLCIVYRD
16E6 56-64 (9)DLCIVYRDG
16E6 57-65 (9)LCIVYRDGN
16E6 53-60 (8)AFRDLCIV
16E6 54-61 (8)FRDLCIVY

* Le nombre d'acides aminés est indiqué entre parenthèses.

Tableau 1. Séquences en acides aminés des peptides E6 du VPH 16 utilisés pour définir la séquence peptidique antigénique minimale et optimale.

Type de VPHRésidus A A*Séquence^
16E6 52-61(10)FAFRDLCIVY
18E6 47-56 (10)FAFKDLFVVY
31E6 45-54 (10)FAFTDLTIVY
33E6 45-54 (10)FAFADLTVVY
35E6 45-54 (10)FACYDLCIVY
39E6 47-56 (10)FAFSDLYVVY
45E6 47-56 (10)FAFSDLYVVY
51E6 45-54 (10)VAFTEIKIVY
52E6 45-54 (10)FLFTDLRIVY
56E6 48-57 (10)FACTELKLVY
58E6 45-54 (10)FVFADLRIVY
59E6 47-56 (10)FAFNDLFIVY
68E6 47-56 (10)FAFGDLNVVY
73E6 45-54 (10)FAFSDLCIVY

* Le nombre d'acides aminés est indiqué entre parenthèses.
^ Les résidus d'acides aminés différents de ceux de l'épitope E6 du VPH-16 52-61 sont indiqués en caractères gras.

Tableau 2. Séquences d'acides aminés des peptides, issus de types de VPH à haut risque, homologues des épitopes T CD8 du VPH 16 E6 52-61, testés pour évaluer la reconnaissance croisée.

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Discussion

Traditionnellement, les immunologistes tentaient de caractériser de nouveaux épitopes T en stimulant les lymphocytes T d'intérêt in vitro, puis en réalisant une expérience de dilution limitante afin d'isoler les clones de lymphocytes T spécifiques de l'épitope. Ensuite, les clones de lymphocytes T étaient caractérisés à l'aide d'un test de libération de chrome 8,9. Toutefois, de nombreuses tentatives se sont révélées infructueuses, car la fréquence des lymphocytes T pouvait être trop faible pour perme...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n'ont rien à divulguer.

Remerciements

Cette étude a été soutenue par une bourse American Cancer Society Scholars (RSG-06-180-01-MBC) et par des subventions des NIH (R01 CA143130 et UL1RR029884).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Kit d'isolement des cellules T CD8Miltenyi Biotec130-094-156
PhytohémagglutinineRemel, Thermo Fisher ScientificR-308528012 mg/vial
Milieu de Yssel’sGemini Bio Products400-102Sérum humain poolé à 1 %
Plaque 96 puits à fond rondBD Biosciences08-772-17
Interleukine-2 humaine recombinanteR&D Systems202-IL-05050μg
Plaque 24 puitsCorning07-200-84
Solution saline tamponnée au phosphateCellgroMT-21-031-CV
Anticorps monoclonal primaire anti-IFN-γ (D1K)Mabtech3420-3-1000
Anticorps monoclonal anti-IFN-γ conjugué à la biotine (7B-6)Mabtech3420-6-1000
Plaque ELISPOT Multiscreen HAEMD MilliporeMAHA S45 10
DiméthylsulfoxydeSigma-AldrichD2650Flacon de 100 ml
Sérum humain pooléAtlanta BiologicalsS40510HInactiver par la chaleur
RPMI 1640CellgroMT-10-040-CV
Tween-20Sigma-AldrichP2287-100ml
Kit Vectastain Elite ABCVector LaboratoriesNC9313719
Diaminobenzidine stableOpen BiosystemsMBI 1241
Lecteur ELISPOT AID EliSpot Reader ClassicAutoimmun Diagnostika GmbHELR06

Références

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