Isolement des oligomères de PrP solubles et insolubles dans le cerveau humain normal

1. Préparation d'homogénat de cerveau et de la détergence soluble (S2) et insoluble (P2) Fractions

1. Prenez 100 mg de tissu congelé cerveau humain et ajouter 100 ul de tampon de lyse (10 mM Tris, 150 mM NaCl, 0,5% de Nonidet P-40 (NP-40), 0,5% d'EDTA, pH 7,4).
2. Homogénéiser le mélange sur de la glace en utilisant un pilon entraîné par un moteur sans fil, le congeler dans de la glace sèche pendant 5 min et l'homogénéiser à nouveau en utilisant un pilon tirée par la main d'abord, puis par le moteur, et ajouter 300 ul ou 800 ul de tampon de lyse (il s'agit soit du 20 % ou 10% homogénat de cerveau total, respectivement).
3. Centrifuger l'homogénat à 20% ou 10% total du cerveau à 1000 xg pendant 10 min à 4 ° C pour ramasser le surnageant (S1) à l'aide d'une centrifugeuse de paillasse.
4. Ultracentrifugeuse S1 10% à 35.000 tours par minute (100.000 xg) dans un rotor SW55 (Beckman Coulter, Fullerton, CA) pendant 1 h à 4 ° C. Transférer les surnageants (S2) qui contiennent la fraction soluble dans du détergent dans un tube propre. Remettre en suspension les granulés qui contiennent un détergent insoluble dans l'fraction (P2) dans 100 ul ou 200 ul du tampon de lyse pour faire 10 - ou 5-fois la préparation concentrée.
5. Pour PK-digestion, incuber l'échantillon avec les mêmes quantités de PK à 50 pg / ml à 37 ° C pendant 1 heure pour les deux fractions S2 et P2. Ajouter fluorure de phénylméthylsulfonyle à la concentration finale de 5 mM et des volumes égaux de tampon d'échantillon SDS (3% de SDS, EDTA 2 mM, 4% β-mercaptoéthanol, 10% de glycérol, 50 mM de Tris, pH 6,8) pour mettre fin à la digestion PK. Faire bouillir les échantillons pendant 10 minutes et les refroidir à la température ambiante pendant 5 min. Ils sont prêts pour Western blot.

2. La sédimentation de vitesse dans Dégradés Étape saccharose

1. Incuber 450 ul S1 20% avec un volume égal de sarkosyl 2% dans H ₂ O pendant 30 min sur la glace.
2. Ajouter 0,5 ml de chacune des 60%, 30%, 25%, 20%, 15% et 10% de saccharose dans un tube Beckman avec un maximum de capacité de 5 ml.
3. Charger 0,4 ml de S1 sur la partie supérieure de 10-60% gradients de saccharose étape.
4. Centrifuger à 48000 rpm (200.000 xg, SW55 rotor) pendant 1 heure, à 4 ° C.
5. Collecter 283 ul de chaque fraction de haut du tube et obtenir 12 fractions au total.
6. Prenez 20 ul de chaque fraction dans un nouveau tube Eppendorf, ajouter 20 ul de tampon d'échantillon, et faire bouillir pendant 10 minutes.
7. Échantillons frais pendant 4 min dans le capot, centrifuger à 1000 xg pendant 1 min et les vortex. Charger les échantillons sur un gel préfabriqué.

3. Chromatographie d'exclusion stérique

1. Utilisez Superdex 200 billes RH (Pharmacia, Uppsala, Suède) dans une colonne de 1 x 30 cm pour déterminer l'état oligomérique de molécules de PrP.
2. Sept marqueurs de masse moléculaire (Sigma, St. Louis, MI), y compris dextran bleu (2.000 kDa), la thyroglobuline (669 kDa), apoferritine (443 kDa), β-amylase (200 kDa), l'alcool déshydrogénase (150 kDa), albumine ( 66 kDa) et de l'anhydrase carbonique (29 kDa) sont chargés indépendamment aux concentrations recommandées par Sigma dans 200 volumes d'échantillons ul.
3. Le volume d'élution de bleu dextran est utilisé pour déterminer le volume de vide (V ₀ = 8,45 ml) et le volume total (V _t = 24 ml) est fourni par l'instruction de produit. Les volumes d'élution de crête (V _e) sont calculés à partir du chromatogramme et retenues fractionnaires. K _av, le coefficient de partage (définissant le comportement de l'échantillon), est calculé en utilisant l'équation: K _av = (V _e - V ₀₎ / (V _t - V _0). La courbe d'étalonnage est déterminée par tracé de _l'av K des protéines étalons contre le log de ​​la MW normes ^8.
4. La masse moléculaire (MW) de différentes espèces de PrP récupérés dans différentes fractions FPLC est évaluée selon une courbe d'étalonnage générée avec la filtration sur gel de différentes normes.
5. Injecter 200 S1 ul dans un tampon de lyse contenant sarkosyl 1% dans la colonne pour chaque essai.
6. Chromatographie est effectuée dans un système FPLC (GE Healthcare) à un débit de 0,25 ml / min et les fractionss de 0,25 ml chacune sont recueillies au moyen d'un collecteur de fractions (Amersham Biosciences, RediFrac).
7. Incuber 0,125 ml de chaque fraction de 0,5 ml prérefroidi méthanol à -20 ° C pendant 2 heures.
8. Centrifuger les échantillons à 13.000 xg pendant 30 min à 4 ° C dans une centrifugeuse de paillasse. Jeter le surnageant et remettre en suspension le culot dans 20 ul de tampon d'échantillon SDS comme mentionné ci-dessus, faire bouillir pendant 10 minutes, laisser refroidir à température ambiante, les charger sur un gel préfabriqué.

4. Capture de PrP par G5p

1. La molécule G5p (100 ug) (aimablement fourni par les Drs. Geoff et John Kneale McGeehan de l'Université de Portsmouth, Royaume-Uni) est conjugué à 7 x 10 ⁸ tosyle activé billes magnétiques par incubation de 100 G5p ug et 350 perles G5p ul dans 1 ml de tampon phosphate salin (PBS) à 37 ° C pendant 20 h. Attirer G5p-billes sur la paroi latérale des tubes Eppendorf par une force magnétique externe, puis enlever toute solution. Laver les billes avec 1 ml de PBS contenant0,1% de sérum albumine bovine (BSA) pour trois fois.
2. Incuber les perles G5p conjugués dans 1 ml de 0,2 M de Tris-HCl, pH 7,4, contenant 0,1% de BSA à 37 ° C pendant 5 heures à bloquer la liaison non spécifique, puis laver les billes avec 1 ml de PBS contenant 0,1% de BSA pendant trois fois comme indiqué ci-dessus. Eliminer la solution et ajouter 1 ml de PBS dans les billes. Les perles G5p préparés sont stables pendant au moins 3 mois à 4 ° C.
3. La capture de la PrP par G5p est réalisé en incubant 100 pl fractions S1 ​​ou P2 avec 60 ul de billes conjuguées G5p (10 pg de protéine / 6 X 10 ⁷ perles) dans 1 ml de tampon de liaison (3% de Tween-20, NP-3% 40 en PBS, pH 7,5).
4. Après incubation avec rotation constante pendant 3 heures à température ambiante, les billes contenant la PrP G5p sont attirés par la paroi latérale des tubes Eppendorf par une force magnétique externe, ce qui permet de retirer facilement les molécules non liées dans la solution.
5. Après trois lavages dans du tampon de lavage (2% de Tween-20 et 2% de NP-40 dans du PBS, pH 7.5), Perles G5p sont collectées et chauffé à 95 ° C pendant 5 min dans le tampon d'échantillon SDS (3% de SDS, EDTA 2 mM, glycérol 10%, 50 mM Tris-HCl, pH 6,8).
6. Après refroidissement des échantillons pendant 5 min à température ambiante, les échantillons sont centrifugés à 1000 xg pendant 5 min à température ambiante. Les surnageants sont prêts pour Western blot.

5. Western Blot

1. Charger les échantillons bouillis dans du tampon d'échantillon SDS sur 15% de Tris-HCl Critère préfabriqués gels (Bio-Rad) à 150 V pour ~ 80 min.
2. Les protéines sur les gels sont transférés au PVDF pendant 2 heures à 70V.
3. Après le blocage des membranes dans le lait 5% dans du Tris-solution saline tamponnée contenant 0,01% de Tween-20 (TBS-T), les membranes sont incubées pendant 2 h à température ambiante avec 3F4 primaires d'anticorps monoclonaux ou polyclonaux (1:40,000), 1E4 (1 : 1.000), anti-N ⁸ (1:6,000), ou anti-C ⁸ (1:6,000) pour sonder la molécule de PrP.
4. Après incubation avec HRP-conjugué anticorps de mouton anti-IgG de souris à1:3000, ou d'âne anti-IgG de lapin à 1:3,000 les bandes de PrP sont visualisées sur un film Kodak utilisant ECL Plus, en conformité avec le protocole du fabricant.

6. Les résultats représentatifs

Par rapport à la MCJ sporadiques échantillons, une petite quantité de IPRP ^C a été détectée dans la fraction P2 dans les cerveaux normaux, bien que la plupart des PrP ^C a été récupérée dans la fraction S2 (figure 1). Comme indiqué précédemment ^8, IPRP comptes pour environ 5-25% de la PrP totale, y compris sur toute la longueur et des espèces N-terminale tronquée.

Les analyses par sédimentation sur gradient de saccharose étape a révélé que, bien que la plupart des PrP ^C de non-MCJ cerveaux ont été récupérés dans les fractions de tête 1-3, de petites quantités de PrP ont également été détectée dans les fractions inférieures 9-11 qui contiennent normalement de grands agrégats ⁸ (Figure 2).

Une grande variété d'espèces PrP ^Sc a sonnétion de monomères, oligomères petits aux plus grands agrégats ont été isolés par filtration sur gel dans le cerveau avec la maladie de Creutzfeldt-Jakob (figure 3A). Cependant, une petite quantité d'agrégats plus gros avec un poids moléculaire supérieur à 2000 kDa a également été détectée dans les fractions insolubles de cerveaux normaux (figure 3C). En outre, des dimères et des tétramères de PrP ^C n'ont pas été détectés seulement dans les fractions insolubles, mais aussi dans les fractions solubles (figure 3B et 3C).

Après le traitement PK et PNGase, la PrP capturé par G5p a été détecté avec l'anticorps 1E4 contre PrP97-105 ^8. Trois fragments de base PK-résistants appelé PrP * ^20, * ¹⁹ PrP, et la PrP * ⁷ ont été détectés, la migration à ~ 20 kDa, ~ 19 kDa et environ 7 kDa, respectivement (figure 4, panneau de gauche). Cependant, aucune PrP a été détectée lors de l'anticorps 1E4 a été pré-incubées avec un peptide synthétique qui a une séquence identtique à l'épitope 1E4 (figure 4, panneau du milieu), ce qui indique que les bandes détectées par 1E4 sont des fragments de PrP. En outre, l'anticorps anti-C a révélé deux fragments différents PrP migration à ~ 18 kDa (PrP * ¹⁸⁾ et ~ 12-13 kDa (PrP-CTF12/13), en plus de la PrP * ²⁰ (figure 4, panneau de droite).

Figure 1. Détection des IPRP ^C et ^Sc IPRP. Après traitement par la PNGase F au 1/10 du volume réactionnel total à 37 ° C pendant 1 heure pour éliminer les glycanes de la protéine pleine longueur ou N-terminale tronquée espèces PrP dans les fractions soluble et insoluble (S2 et P2) isolé par ultracentrifugation dans des échantillons de cerveau de contrôle normal (CTL) et la MCJ sporadique (MCJ) ont été détectés avec 3F4 contre PrP106-112 (panneau de gauche), anti-N contre PrP23-40 (panneau du milieu), et anti-PrP C contre220-231 (panneau de droite). Dans des échantillons de CTL, une petite quantité de PrP est détectée dans P2, tandis qu'une quantité importante est présente dans S2. En revanche, plus la PrP est détecté dans P2 par rapport à S2 dans des échantillons MCJs.

Figure 2. Sédimentation de la PrP dans des gradients de saccharose étape. PrP dans les différentes fractions de 1 à 11 de non-MCJ échantillon S1 cerveau a été détectée par Western blot avec 3F4. Bien que la plupart de la PrP ^C a été détectée dans les fractions top 1-3, de petites quantités de PrP ont également été observées dans les fractions inférieures 9-11. En outre, le motif de bandes de PrP du haut et du bas est différente: la PrP récupérés dans les fractions de tête présente une bande dominante supérieure alors que la PrP récupérés dans les fractions bas présente une bande dominante inférieure. Un PK-traitée PrP ^Sc a été chargé comme un contrôle sur le côté droit de la tache.

Figure 3. Détection des oligomères solubles et insolubles ^C PrP. Soluble et insoluble de PrP ^C cerveaux humains normaux ont été séparées par ultracentrifugation, puis soumis à une filtration sur gel, respectivement. Les tailles moléculaires des fractions individuelles ont été mesurées par l'exécution d'un groupe de marqueurs de masse moléculaire. (A) PrP ^Sc espèces à partir d'échantillons de cerveau MCJs. Deux populations d'espèces de PrP ont été détectés: fractions de filtration sur gel de 49 à 65 contiennent des monomères et des oligomères petits, tandis que les fractions 27-33 contiennent des agrégats de grande taille. Les espèces de PrP ^C de la fraction soluble (S2) (B) et une fraction insoluble (P2) (C) de témoins normaux ont été détectés. PrP a été sondé avec l'anticorps 3F4. Dimères (fraction 55) et tétramères (fraction 51) de la PrP ont été détectés non seulement en P2, mais aussi dans S2 de sampl normal du cerveaues (B et C). Grands agrégats n'ont été détectés que dans des échantillons normaux P2 (C).

Figure 4. Détection des différents fragments IPRP PK-résistants dans G5p préparations enrichies de cerveaux humains normaux. Échantillons enrichis par G5p ont été traités avec PK et PNGase F avant de Western blot sondage avec 1E4 (panneau de gauche), 1E4 pré-incubées avec un peptide synthétique qui a une séquence identique à l'épitope 1E4 (panneau du milieu), et anti-C ( panneau de droite). 1E4 détecté trois PK-résistants fragments PrP appelée PrP * ^20, * ¹⁹ PrP, et la PrP * ⁷ (panneau de gauche). Après le blocage du 1E4 avec le peptide, aucune PrP ^res ont été détectés (panneau central), ce qui indique que les bandes détectées avec 1E4 sont des fragments de PrP. Anti-C a révélé deux fragments ajout PrP PK-résistants appelé PrP * ¹⁸ et PrP-CTF12 /13, en plus de la PrP * ^20.

Aucun conflit d'intérêt déclaré.