Microarray Anticorps chimiquement bloqué pour multiplexée à haut débit de profilage de glycosylation des protéines spécifiques dans les échantillons complexes

Résumé

Dans cette étude, nous décrivons un protocole amélioré pour une puce anticorps à haut débit multiplexées avec la méthode de détection lectine qui peut être utilisé dans le profilage de glycosylation des protéines spécifiques. Ce protocole propose de nouveaux réactifs fiables et réduit considérablement le temps, le coût et les besoins en équipement de laboratoire par rapport à la procédure précédente.

Résumé

Dans cette étude, nous décrivons un protocole efficace destiné à un microdispositif d'anticorps multiplexé à haut débit avec détection par protéines liant les glycanes, permettant le profilage de la glycosylation de protéines spécifiques. La glycosylation des protéines est la modification post-traductionnelle la plus répandue sur les protéines, et entraîne des modifications diversifiées de leurs propriétés physiques, chimiques et biologiques. Étant donné que les mécanismes de glycosylation sont particulièrement sensibles à la progression des maladies et aux transformations malignes, une glycosylation anormale a été reconnue comme biomarqueur de détection précoce du cancer et d'autres maladies. Toutefois, les méthodes actuelles d'étude de la glycosylation des protéines sont généralement trop complexes ou coûteuses pour être utilisées dans la plupart des laboratoires courants ou des contextes cliniques, d'où la nécessité d'une méthode plus pratique. Le nouveau protocole décrit dans cette étude utilise un microdispositif d'anticorps chimiquement bloqué avec détection par protéines liant les glycanes (PLG) et réduit considérablement le temps, le coût et les besoins en équipement de laboratoire pour l'étude de la glycosylation des protéines. Dans cette méthode, plusieurs anticorps spécifiques des glycoprotéines immobilisés sont imprimés directement sur les lames de microdispositif, et les N-glycanes présents sur les anticorps sont bloqués. Les anticorps spécifiques des glycoprotéines bloqués et immobilisés sont alors capables de capturer et d'isoler des glycoprotéines à partir d'un échantillon complexe appliqué directement sur les lames de microdispositif. La détection des glycanes peut ensuite être réalisée par l'application de lectines biotinylées et d'autres PLG sur la lame de microdispositif, tandis que les niveaux de liaison peuvent être déterminés à l'aide de streptavidine Dylight 549. Grâce à l'utilisation d'un panel d'anticorps et à la sonde avec plusieurs lectines biotinylées, cette méthode permet d'établir un profil de glycosylation efficace des différentes protéines présentes dans un échantillon humain ou animal donné.

Introduction

La glycosylation des protéines, qui est la modification post-traductionnelle la plus répandue sur les protéines, modifie les propriétés physiques, chimiques et biologiques d'une protéine et joue un rôle fondamental dans divers processus biologiques^1-6. Étant donné que la machinerie de glycosylation est particulièrement sensible à la progression de la maladie et à la transformation maligne, une glycosylation anormale a été reconnue comme un biomarqueur de détection précoce du cancer et d'autres maladies. ^7-12. En effet, la plupart des biomarqueurs tumoraux actuels, tels que la fraction L3 de α-1 fœtoprotéine (AFP) pour le carcinome hépatocellulaire ^13-15et CA199 pour le cancer du pancréas ^{16, 17} sont tous des motifs glucidiques anormaux présents sur les glycoprotéines. Toutefois, les méthodes d'étude de la glycosylation des protéines se sont révélées complexes et inadaptées aux laboratoires de routine et aux contextes cliniques. Chen et al. a récemment mis au point un microréseau d'anticorps chimiquement bloqué associé à une méthode de détection par protéines liant les glycanes (GBP) permettant le profilage, à haut débit et en multiplex, de la glycosylation de glycoprotéines natives dans un échantillon complexe ¹⁸. Dans cette méthode de puces à ADN basée sur l'affinité, de multiples anticorps spécifiques des glycoprotéines immobilisés capturent et isolent directement les glycoprotéines à partir d'un mélange complexe sur la lame de puces, et les glycanes associés à chaque protéine capturée individuellement sont mesurés à l'aide de GBP. Étant donné que tous les anticorps normaux contiennent des N-glycanes pouvant être reconnus par la plupart des GBP, l'étape cruciale de cette méthode consiste à bloquer chimiquement les glycanes présents sur les anticorps afin d'empêcher leur liaison aux GBP. Dans la procédure, les cisLes groupes -diol des glycanes présents sur les anticorps ont d'abord été oxydés en groupes aldéhyde à l'aide de NaIO₄.₄ dans un tampon d'acétate de sodium en évitant la lumière. Les groupes aldéhyde ont ensuite été conjugués au groupe hydrazide d'un agent de liaison croisée, le chlorure d'acide 4-(4-N-maleimidophényl)butyrique hydrazide (MPBH), suivi de la conjugaison d'un dipeptide, Cys-Gly, au groupe maléimide du MPBH. Ainsi, les groupes cis-diol des glycanes des anticorps ont été convertis en groupes volumineux non hydroxyles, ce qui entrave la liaison des lectines et autres GBP aux anticorps de capture. Cette procédure de blocage permet aux GBP et aux lectines de ne se lier qu'aux glycanes des protéines capturées. Après ce blocage chimique, les échantillons sériques ont été incubés avec la matrice d'anticorps, suivis par la détection des glycanes à l'aide de différentes lectines et GBP biotinylées, puis visualisés avec la streptavidine-Cy3. L'utilisation parallèle d'un ensemble d'anticorps et de plusieurs sondes de lectines fournit des profils de glycosylation distincts pour de multiples protéines dans un échantillon donné ^18-20. Cette méthode a été utilisée avec succès dans plusieurs laboratoires différents ^{1, 7, 13, 19-31}Cependant, la stabilité du MPBH et du Cys-Gly, ainsi que la procédure complexe et longue de cette méthode, affectent la reproductibilité, l'efficacité et le rendement de la méthode. Dans ce nouveau protocole, nous avons remplacé à la fois le MPBH et le Cys-Gly par un réactif beaucoup plus stable, l'hydrazide de l'acide glutamique (Glu-hydrazide), ce qui a considérablement amélioré la reproductibilité de la méthode et simplifié et raccourci l'ensemble de la procédure, de sorte qu'elle peut être réalisée en une seule journée de travail. Dans ce nouveau protocole, nous décrivons la procédure détaillée, facilement adoptable par les laboratoires courants pour l'étude de routine de la glycosylation des protéines, ainsi que les techniques nécessaires pour obtenir des résultats reproductibles et reproductibles.

Protocole

1. Imprimer une Microarray Anticorps pour le test

1. Diluer tous les anticorps à 0,5 mg / ml dans une solution saline de tampon phosphate, pH 7,2 (PBS).
2. Aliquoter 40 ul de chaque anticorps dans la plaque de source de 384 puits.
3. Charger la plaque de source de 384 puits sur le microarrayer sciFLEXARRAYER Scienion.
4. Chargez 20 diapositives microarray PATH sur le microarrayer en tant que cible.
5. Réglez le microarrayer d'imprimer 48 sous-réseaux identiques, dans lequel 27 anticorps et les protéines de contrôle sont repérés en triple exemplaire dans un modèle 9x9 (figure 1E, 1F).
6. Démarrez le micro....

Discussion

1. Protéine cible et la sélection d'anticorps de capture

Avant le dosage d'anticorps microarray, certains réactifs et matériels sont nécessaires pour être considéré et préparé. Pour concevoir un microréseau d'anticorps pour le profilage ou le dépistage des biomarqueurs glycane glycane, un panel d'anticorps spécifiques aux candidats glycoprotéine devrait être déterminée en fonction de la littérature ou à partir des résultats précédents. Ces anticorps ont été généralement achetés .......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
ID	Nom du réactif	Abréviation	Entreprise	Catalogue #
L1	Biotinylé concanavaline A	ConA	Vector Laboratories	BK-1000
L2	Biotinylé Sambucus Nigra Lectin	SCN	Vector Laboratories	B-1305
L3	Biotinylé Lens culinaris Agglutinin	LCA	Vector Laboratories	BK-2000
L4	Biotinylés agglutinine de Ricinus communis, je	RCA	Vector Laboratories	BK-1000
L5	Biotinylé Aleuria Aurantia Lectin	AAD	Vector Laboratories	B-1395
L6	Biotinylé Erythrina cristagalli Lectin	ECL	Vector Laboratories	BK-3000
L7	Biotinylé Griffonia (Bandeiraea) Lectin Simplicifolia II	GSL II	Vector Laboratories	BK-3000
L8	Biotinylé de germe de blé Agglutinin	WGA	Vector Laboratories	BK-1000
L9	Biotinylé Erythroagglutinin Phaseolus vulgaris	PHA-E	Vector Laboratories	BK-2000
L10	Biotinylé Leucoagglutinin Phaseolus vulgaris	PHA-L	Vector Laboratories	BK-2000
L11	Agglutinin arachide biotinylé	PNA	Vector Laboratories	BK-1000
L12	Biotinylés Pisum sativum Agglutinin	PSA	Vector Laboratories	BK-2000
L13	Biotinylé Dolichos biflorus Agglutinin	DBA	Vector Laboratories	BK-1000
L14	Biotinylé Lectin Datura stramonium	DSL	Vector Laboratories	BK-3000
L15	Biotinylé Sophora japonica Agglutinin	ASJ	Vector Laboratories	BK-2000
L16	Agglutinine du soja biotinylé	SBA	Vector Laboratories	BK-1000
L17	Biotinylé Solanum tuberosum (pomme de terre) Lectin	STL	Vector Laboratories	BK-3000
L18	Biotinylé Griffonia (bandeeiraea) Simplicifolia Lectin je	GSL, je	Vector Laboratories	BK-2000
L19	Biotinylé Vicia villosa Lectin	VVL	Vector Laboratories	BK-2000
L20	Biotinylé Lycopersicon esculentum (tomate) Lectin	LIE	Vector Laboratories	BK-3000
L21	Ulex biotinylé Europaeus Agglutinin je	UEA I	Vector Laboratories	BK-1000
L22	Biotinylé jacaline	Jacaline	Vector Laboratories	BK-3000
A1	F de chèvre (ab ') 2 Fragment IgM anti-humain, un anticorps Fc5μ	IgM	Jackson Immuno Research	109-006-129
A2	Ane F (ab ') 2 Frag anti-IgG humaine (H + L) unetibody	AB1	Jackson Immuno Research	709-006-149
A3	Souris anti-IgG humaine F (ab ') 2 d'anticorps monoclonal	AB3	Jackson Immuno Research	209-005-097
A4	De chèvre anti-anticorps humain alpha macroglobuline 2 polyclonal	A2M	GeneTex	GTX62924
A5	De lapin anti-alpha humain-1-antitrypsine d'anticorps polyclonaux	A1AT	Lee Biosiences	CA1T-80A
A6	Souris anti-humaine alpha-1-antitrypsine anticorps monoclonal	A1AT	Sigma-Aldrich	SAB4200198
A7	De lapin anti-alpha humain-1-antitrypsine d'anticorps polyclonaux	AGIR	NeoMarkers	RB-367-A1
A8	De lapin anti-humainl'alpha-1-antichymotrypsine anticorps polyclonal	AGIR	Fisher Scientific	RB9213R7
A9	Souris anti-transferrine humaine d'anticorps monoclonal	La transferrine	GeneTex	GTX101035
A10	De lapin anti-transferrine humaine d'anticorps polyclonaux	La transferrine	GeneTex	GTX77130
A11	De chèvre anti-humain apolipoprotéine J anticorps polyclonaux	ApoJ	Abcam	ab7610
A12	De souris anti-humaine GP73 anticorps monoclonal	GP73	Abbott	14H4-23
A13	De souris anti-humaine GP73 anticorps monoclonal	GP73	Santa Cruz Biotechnology INC	sc-101275
A14	De lapin anti-humain alpha-1 fetoprotein anticorps polyclonal	AFP	Genway	GWB-41C966
A15	Souris anti-humaine alpha-1 foetoprotéine anticorps monoclonal	AFP	Fitzgerald	10-A05A
A16	Souris anti-humaine hémopexine anticorps monoclonal	Hemopexin	Assaypro	60190-05011
A17	Souris anti-humaine glypicane-3 (1G12) anticorps monoclonal	GPL3	Santa Cruz Bio	sc-65443
A18	Souris anti-humaine kininogène (LMW) anticorps monoclonal	Kininogène	Assaypro	20333-05011
A19	De lapin anti-humain MMP-21 anticorps monoclonal	MMP21	Epitomic	1955-1
A20	Souris anti-humaine-1 CEACAM antibod monoclonaly	CEACAM	R & D Systems	MAB1180
A21	Rat anti-humaine DPPIV/cd26 anticorps monoclonal	DPPIV	R & D Systems	MAB22441
A22	Souris anti-humaine PIVKA II anticorps monoclonal	PIVICA	Cristal chem	8040
A23	Souris anti-antigène carcino-embryonnaire	CEA	US biologique	C1300
A24	Antigène de souris anti-CA125 cancer	CA125	US biologique	C0050-01D
A25	Souris anti-CA19-9 du cancer antigène	CA19-9	US biologique	C0075-18
A26	Souris anti-Lewis x anticorps monoclonal	X Lewis	Calbiochem	434631
bio	Biotinylé BSA (contrôle positif)	Bio	Home-made	N / A

Nom de / du réactif s équipements	Entreprise	Numéro de catalogue
Microarrayer sans contact	BioDot Inc	sciFLEXARRAYER
384 microplaques	Pêcheur	14-230-243
FoodSaver	FoodSaver	V3835
Ultrathin nitrocellulose Coate microarray glisse	Gentel	PATH
Diapositive impression (en option)	La Société Gel	WSP60-1
Shaker	Pêcheur	15-453-211
Centrifuger	Eppendorf	5804 000.013
Glissez à laver la vaisselle coloration bassin / Slide avec rack amovible	Pêcheur	08-812
Incubation des lames diapositive boîte de chambre / microscope	Pêcheur	03-448-5
Brij 35, solution à 30% p / v dans l'eau	Acros Organics	AC32958-0025
Tween-20	Pêcheur	P337-100
Periodate de sodium (NaIO 4)	Sigma	311448
L-acide glutamique γ-hydrazide	Sigma	G-7257
Acétate de sodium anhydre (CH 3 COONa)	Sigma	S2889
Bovine Serum Albumin (BSA)	Lampire Labs biologique	7500804
Tampon phosphate salin (PBS) (10X)	Denville scientifique	CP4390-48
Dylight 549 neutravidine conjugué	Thermo	22837
Comprimés inhibiteurs de la protéase à cocktails	Roche	4693159001
ChromPure IgG humaine, fragment Fc	Jackson Immunoresearch	009-000-008
ChromPure IgG humaine, molécule entière	Jackson Immunoresearch	009-000-003
ChromPure IgG de souris, molécule entière	Jackson Immunoresearch	015-000-003
ChromPure IgG de souris, le fragment Fc	Jackson Immunoresearch	015-000-008
ChromPure IgG de lapin, molécule entière	Jackson Immunoresearch	011-000-003
ChromPure âne IgG, molécule ensemble	Jackson Immunoresearch	017-000-003
Microarray Scanner	Tecan	LS Reloaded