Microarray Anticorps chimiquement bloqué pour multiplexée à haut débit de profilage de glycosylation des protéines spécifiques dans les échantillons complexes

Summary

Dans cette étude, nous décrivons un protocole amélioré pour une puce anticorps à haut débit multiplexées avec la méthode de détection lectine qui peut être utilisé dans le profilage de glycosylation des protéines spécifiques. Ce protocole propose de nouveaux réactifs fiables et réduit considérablement le temps, le coût et les besoins en équipement de laboratoire par rapport à la procédure précédente.

Abstract

Dans cette étude, nous décrivons un protocole efficace pour une utilisation dans une micropuce à anticorps multiplexée à haut débit avec détection de protéines de liaison aux glycanes qui permet le profilage de glycosylation de protéines spécifiques. La glycosylation des protéines est la modification post-traductionnelle la plus répandue sur les protéines et entraîne des modifications diversifiées des propriétés physiques, chimiques et biologiques des protéines. Parce que la machinerie de glycosylation est particulièrement sensible à la progression de la maladie et à la transformation maligne, la glycosylation aberrante a été reconnue comme biomarqueur de détection précoce du cancer et d’autres maladies. Cependant, les méthodes actuelles d’étude de la glycosylation des protéines sont généralement trop compliquées ou trop coûteuses pour être utilisées dans la plupart des laboratoires ou des cliniques normaux et une méthode plus pratique pour étudier la glycosylation des protéines est nécessaire. Le nouveau protocole décrit dans cette étude utilise une micropuce à anticorps bloquée chimiquement avec détection de la protéine de liaison aux glycanes (GBP) et réduit considérablement le temps, le coût et les exigences en équipement de laboratoire nécessaires pour étudier la glycosylation des protéines. Dans cette méthode, plusieurs anticorps spécifiques de la glycoprotéine immobilisée sont imprimés directement sur les lames de la puce à ADN et les N-glycanes des anticorps sont bloqués. Les anticorps spécifiques des glycoprotéines bloqués et immobilisés sont capables de capturer et d’isoler les glycoprotéines d’un échantillon complexe qui est appliqué directement sur les lames de la puce à puce. La détection des glycanes peut ensuite être effectuée par l’application de lectines biotinylées et d’autres GBP sur la lame de la puce à ADN, tandis que les niveaux de liaison peuvent être déterminés à l’aide de Dylight 549-Streptavidin. Grâce à l’utilisation d’un panel d’anticorps et à l’exploration de plusieurs lectines biotinylées, cette méthode permet de développer un profil de glycosylation efficace des différentes protéines présentes dans un échantillon humain ou animal donné.

Introduction

La glycosylation des protéines, qui est la modification post-traductionnelle la plus omniprésente sur les protéines, modifie les propriétés physiques, chimiques et biologiques d’une protéine, et joue un rôle fondamental dans divers processus biologiques^1-6. Parce que la machinerie de glycosylation est particulièrement sensible à la progression de la maladie et à la transformation maligne, la glycosylation aberrante a été reconnue comme biomarqueur de détection précoce du cancer et d’autres maladies ^7-12. En fait, la plupart des biomarqueurs actuels du cancer, tels que la fraction L3 de la fœtoprotéine α-1 (AFP) pour le carcinome hépatocellulaire ^13-15 et le CA199 pour le cancer du pancréas ^{16, 17} sont tous des fractions glycanes aberrantes sur les glycoprotéines. Cependant, les méthodes d’étude de la glycosylation des protéines sont compliquées et ne conviennent pas aux laboratoires et aux cliniques de routine. Chen et al. ont récemment inventé une micropuce à anticorps chimiquement bloquée avec une méthode de détection de la protéine de liaison aux glycanes (GBP) pour la glycosylation à haut débit et multiplexée des glycoprotéines natives dans un échantillon complexe ¹⁸. Dans cette méthode de micropuce basée sur l’affinité, plusieurs anticorps spécifiques des glycoprotéines immobilisées capturent et isolent les glycoprotéines du mélange complexe directement sur la lame de la puce, et les glycanes de chaque protéine capturée individuellement sont mesurés par GBP. Étant donné que tous les anticorps normaux contiennent des N-glycanes qui pourraient être reconnus par la plupart des GBP, l’étape critique de cette méthode consiste à bloquer chimiquement les glycanes sur les anticorps pour qu’ils ne se fixent pas à la GBP. Dans la procédure, les groupes cis-diol des glycanes sur les anticorps ont d’abord été oxydés en groupes aldéhydes en utilisant du NaIO₄ dans un tampon d’acétate de sodium évitant la lumière. Les groupes aldéhydes ont ensuite été conjugués au groupe hydrazide d’un agent de réticulation, l’hydrazide HCl (MPBH) de l’acide 4-(4-N-MaléimidoPhényl)butyrique, suivi de la conjugaison d’un dipeptide, Cys-Gly, au groupe maléimide du MPBH. Ainsi, les groupes cis-diol sur les glycanes des anticorps ont été convertis en groupes hydroxyles non volumineux, ce qui a entravé les lectines et autres liaisons GBP aux anticorps de capture. Cette procédure de blocage fait que les GBP et les lectines ne se lient qu’aux glycanes des protéines capturées. Après ce blocage chimique, des échantillons de sérum ont été incubés avec la puce à anticorps, suivis de la détection des glycanes à l’aide de différentes lectines biotinylées et GBP, et visualisés avec la cyst3-streptavidine. L’utilisation parallèle d’un panel d’anticorps et d’un sondage multiple des lectines permet d’obtenir des profils de glycosylation discrets de plusieurs protéines dans un échantillon donné ^18-20. Cette méthode a été utilisée avec succès dans plusieurs laboratoires différents ^{1, 7, 13, 19-31}. Cependant, la stabilité de la MPBH et du Cys-Gly, la procédure compliquée et prolongée de cette méthode affectent la reproductibilité, l’efficacité et l’efficience de la méthode. Dans ce nouveau protocole, nous avons remplacé à la fois MPBH et Cys-Gly par un réactif beaucoup plus stable, l’hydrazide d’acide glutamique (glu-hydrazide), ce qui a considérablement amélioré la reproductibilité de la méthode, simplifié et raccourci l’ensemble de la procédure afin qu’elle puisse être terminée en un jour ouvrable. Dans ce nouveau protocole, nous décrivons la procédure détaillée du protocole qui peut être facilement adoptée par les laboratoires normaux pour l’étude de routine de la glycosylation des protéines et les techniques nécessaires pour obtenir des résultats reproductibles et reproductibles.

Protocol

1. Imprimer une Microarray Anticorps pour le test

1. Diluer tous les anticorps à 0,5 mg / ml dans une solution saline de tampon phosphate, pH 7,2 (PBS).
2. Aliquoter 40 ul de chaque anticorps dans la plaque de source de 384 puits.
3. Charger la plaque de source de 384 puits sur le microarrayer sciFLEXARRAYER Scienion.
4. Chargez 20 diapositives microarray PATH sur le microarrayer en tant que cible.
5. Réglez le microarrayer d'imprimer 48 sous-réseaux identiques, dans lequel 27 anticorps et les protéines de contrôle sont repérés en triple exemplaire dans un modèle 9x9 (figure 1E, 1F).
6. Démarrez le microarrayer d'imprimer les diapositives biopuces d'anticorps.
7. Recueillir les diapositives biopuces d'anticorps, et de les stocker dans la cassette diapositives avec déshydratant. Passez l'aspirateur sceller la cassette dans un sac en plastique à l'aide de vide scellant (Foodsaver).
8. Rangez les lames microarray scellées à 4 ° C au réfrigérateur.

2. Chimiquement Bloquer le Microarray Anticorps visant à prévenir GBPLier aux anticorps de capture

Le test commence une fois que les puces à ADN microarray diapositives sont chimiquement bloqué et dure environ 8 heures. Une fois démarré l'essai microarray doit être complété (étapes 2 à 8).

1. Prenez la puce se glisse hors du réfrigérateur, et de les amener à température ambiante pendant 30 minutes.
2. Retirer la lame de la boîte de rangement et brièvement les rincer à pH tampon phosphate salin à 7,2 avec 0,1% de Tween 20 (PBST0.1) une fois dans une diapositive lavabo, puis dans 15 mM, pH tampon acétate de sodium 5,0 avec 0,1% (Tween CBT0 0.1) d'une manière séquentielle. Incuber les lames dans CBT0.1 pendant 10 minutes dans le bassin de lavage diapositive.
3. Préparer une nouvelle solution 150 mM NaIO ₄ à 15 mM de tampon acétate de sodium pH 5,0 (CB), et conservez-le dans dans une diapositive lavabo dans un réfrigérateur tout en évitant la lumière avant de l'utiliser.
4. Retirer la lame de la CB, et le mettre dans le bassin contenant frais NaIO ₄ avec le côté d'anticorpsvers le haut. Couvrez le bassin avec une feuille d'aluminium pour éviter la lumière, et incuber le bassin diapositive pendant 2 heures avec agitation douce à 4 ° C dans un réfrigérateur.
5. Préparer 300 ml de 10 mM d'acide glutamique hydrazide (le bloqueur) dans CB.
6. Retirer la lame du bassin, et brièvement le rincer à CB 3 fois pendant 5 minutes à chaque fois dans le bassin de lavage diapositive.
7. Incuber les lames dans le bloqueur dans un bassin de lavage pour 2 heures à température ambiante sous agitation douce.
8. Retirer les lames du bassin, et les laver avec PBST0.1 pendant 3 minutes.

3. Bloc non-spécifiques de liaisons pour la micropuce de la sérumalbumine bovine (BSA)

1. Préparer 300 ml de BSA 1% dans du tampon phosphate pH 7,2 avec une solution saline à 0,5% de Tween (PBST0.5) dans un bassin de lavage coulisseau, et incuber le coulisseau microréseau dans le bassin pendant 1 heure à température ambiante avec agitant doucement.
2. Rincer les lames dans PBST0.1 trois fois pendant 3 minutes à chaque fois.
3. Mettre la diapositivesur une grille coulissante, et tournent à 1200 xg sur une centrifugation pendant 2 minutes pour sécher la lame puces à ADN.

4. Grille de cire Mentions légales sur la lame de puces à ADN pour séparer chaque sous-réseau

1. Préchauffer le dispositif d'impression de cire à 70 ° C pendant 5 minutes.
2. Charger le coulisseau microréseau bloquée dans le dispositif d'impression de la cire avec le côté faisant face à l'anticorps de la cire. Tirez doucement sur la poignée à la cire empreinte sur la lame régulièrement.

5. Appliquer échantillons de sérum sur la lame de puces à ADN

1. Lors de l'étape 2.4, la préparation des échantillons de sérum pour dosage soit profilage glyco dans un échantillon (5.1.1), ou simple glyco epiptope mesures parmi plusieurs échantillons (5.1.2).
   1. Dans une expérience pour les profilages glycanniques de plusieurs glycoprotéines sériques dans un échantillon de sérum en utilisant plusieurs Gbps (voir 1 expérience de l'échantillon), un des échantillons de sérum sera appliquée sur tous les sous-réseaux. Dans ce cas, 40 pl amplement le sérum est dilué dans pl 360 de PBS contenant 0,1%Tween-20, 0,1% Brij 35, 100 ug / ml de IgG de souris, 100 ug / ml de IgG de rat, 100 ug / ml de IgG de lapin, 100 ug / ml de IgG de chèvre et de 100 pg / ml d'âne IgG. Ce volume est suffisant pour l'application de 6 pi de solution de sérum dilué sur chaque sous-réseau.
   2. Dans une expérience pour la mesure d'une glycane sur plusieurs protéines sériques entre plusieurs échantillons de sérum en utilisant un détections GBP (voir 2 l'expérience de l'échantillon). Dans ce cas, 1 pl amplement sérum est dilué dans 9 ul de PBS contenant 0,1% de Tween-20, 0,1% Brij 35, 100 ug / ml de IgG de souris, 100 ug / ml de IgG de rat, 100 ug / ml de IgG de lapin , 100 ug / ml de IgG de chèvre et 100 pg / ml d'âne IgG. Ce volume est suffisant pour l'application de 6 pi de solution de sérum dilué sur chaque sous-réseau.
2. Après empreinte de cire à l'étape 4, appliquez soigneusement 6 pi d'échantillon dilué ou des échantillons de contrôle (PBST0.1) à chaque sous-tableau de la diapositive. Incuber la lame dans une cassette humidifié avec du papier absorbant humide à la température ambiantependant 1 heure.
3. Rincer la lame avec PBST0.1 trois fois pendant 3 minutes à chaque fois.
4. Sécher la lame en le tournant à 1200 xg pendant 2 minutes.

6. Appliquer biotinylé GBP (Anticorps anti-lectine ou glycane) sur la glissière

1. Lors de l'étape 2.4, préparer des lectines biotinylées 10μg/ml ou Gbps en PBST0.1.
   1. Dans l'expérience de profilage glycane que la sonde un échantillon avec des lectines multiples (1 expérience de l'échantillon), préparer 350 pi de lectine biotinylée qui est suffisant pour tous les sous-réseaux.
   2. En simple glycane épitope / biomarqueur de dépistage dans de multiples échantillons en utilisant des lectines multiples, préparer 10 ul de chaque lectine biotinylée qui est suffisant pour un sous-réseau.
2. Appliquer 6 pl de la lectine biotinylée dilué (s) à chaque sous-tableau de la diapositive, et incuber dans la boîte de diapositive humidifié avec du papier absorbant humide à température ambiante pendant 1 heure.
3. Rincer les lames avec PBST0.1 trois fois pendant 3 minutes de chaque timoi.
4. Sécher la lame en le tournant à 1200 xg dans une centrifugeuse pour 2 minutes.

7. Appliquer de la teinture neutravidine Étiqueté pour la détection par fluorescence

1. Préparer 350 pi de Dylight 549 neutravidine étiqueté qui est suffisant pour tous les sous-réseaux.
2. Appliquer 6 pi de Dylight 549 neutravidine marqué sur chaque sous-réseau, et incuber la lame dans la cassette diapositive humide à température ambiante pendant 1 heure.
3. Rincer la lame avec PBST0.1 trois fois pendant 3 minutes à chaque fois.
4. Sécher la lame en faisant tourner la il à 1200 xg dans une centrifugeuse pour 2 minutes.

8. Obtenir image de la diapositive Microarray par balayage de la diapositive

1. Numérisation de la diapositive en utilisant un scanner de fluorescence à puce une résolution de 10 um. Les paramètres du laser et PMT devrait être aussi fort que possible, mais pas de point de saturation est observée.

9. Extraction et analyse des données

1. Ouvrez l'image dans ArrayPro 3.2.
Mettre en place le modèle réseau selon la carte réseau qui montre les taches d'anticorps endroits. Alignez soigneusement chaque cercle gabarit sur l'endroit correspondant dans l'image.
2. Extrait de l'intensité de chaque spot dans un fichier Excel pour une analyse plus approfondie.

10. Les résultats représentatifs

1 Exemple d'expérience

La glycosylation de profilage plusieurs glycoprotéines sériques dans l'échantillon du patient carcinome hépatocellulaire sérum en utilisant des anticorps microarray chimiquement bloqué avec détection des lectines multiples.

Le but de cette expérience est d'explorer le profil de glycosylation des glycoprotéines individuelle de 20 dans le carcinome hépatocellulaire (HCC) de l'échantillon de sérum du patient à l'aide de puces à ADN d'anticorps chimiquement bloqué avec détection de lectine. Une puce à ADN d'anticorps, qui contient 48 sous-réseaux identiques qui comprennent 26 anticorps et la biotine-BSA, a été conçu et fabriqué comme décrit dans Step 1. Ces anticorps étaient 26 contre 20 glycoprotéines sériques que identifiés comme prometteurs valeur diagnostic précoce pour les patients HCC en utilisant la lectine immunoprécipitation combinée avec des l'identification des protéines par spectrométrie de masse ^{12, 32} comme indiqué dans le tableau 1. Le motif et l'agencement des points imprimés en triple anticorps dans un sous-matrice représentant sont représentés à la figure 1E et 1F, respectivement. Deux lames microarray identiques, on n'était pas bloqué chimiquement (figure 1A), tandis que l'autre a été (figure 1B), ont été utilisés pour réaliser l'expérience de glycosylation même profilage afin de démontrer l'importance de la procédure de blocage chimiquement à l'analyse. Pour la diapositive chimiquement bloqué (figure 1B), l'expérience a commencé à l'étape 2, car il n'en diapositive chimiquement bloqué (figure 1A), l'expérience a débuté à l'étape 3. L'expérience a été réalisée par following toutes les étapes décrites dans le protocole, sauf pour l'étape 5.1.2 et 6.1.2. Dans l'étape 5.2, un échantillon de contrôle PBST0.1 a été appliqué sur sous-réseaux dans la colonne 1 et 3, et une mise en commun HCC échantillon de sérum a été appliqué sur sous-réseaux dans la colonne 2 et 4, respectivement (comme le montre la figure 1G). Cette comparaison est de montrer l'efficacité, l'efficience de la procédure, ainsi que l'affinité de liaison d'antigène des anticorps après chimiquement blocage. 22 lectines biotinylées (comme indiqué dans le tableau 1) que spécifique à différents glycanes ^{18, 20} ont été appliquées sur chaque sous-réseau comme le montre la figure 1G pour le profilage de glycosylation. Images des chimiquement bloqués (figure 1B) et non-chimiquement bloqué (figure 1A) puces après le dosage de profilage glycosylation en suivant le protocole. Comme indiqué dans les sous-réseaux dans la colonne 1 et 3 dans les pays non-chimiquement puces bloquées (figure 1A et figure 1C), sur lequelseulement PBST0.1 a été appliqué, la plupart des lectines lié à anticorps de capture, et a montré de fond très élevé que ces sous-réseaux comparables à la colonne 2 et 4, sur lequel l'échantillon de sérum a été appliquée. Il est impossible d'obtenir des informations de profil glycane à partir de cette diapositive puces à ADN. Au contraire, lorsque la même expérience a été faite sur une diapositive microréseau d'anticorps chimiquement bloqué, les sous-réseaux dans la colonne 1 et 3, sur lequel a été appliqué seulement PBST0.1, la plupart des lectines ont montré les liaisons pas ou très faible pour capturer les anticorps, tandis que l'antigène de haute liaisons étaient encore observées dans les sous-réseaux dans la colonne 2 et 4, sur lequel un échantillon de sérum a été appliquée (figure 1B et 1D). Ces résultats ont montré la procédure de blocage chimiquement était une étape essentielle avant la mesure de glycanes sur des anticorps capturés glycoprotéines. En suivant le protocole, profils de glycosylation des glycoprotéines dans 22 HCC sérum peut être obtenu.

Expérience 2

Écran pour fucos modifiésylation sur glycoprotéines sériques spécifiques comme biomarqueurs pour la cirrhose du foie et de discrimination patients atteints de carcinome hépatocellulaire.

Le but de cette expérience est à l'écran pour fucosylation altérée sur glycoprotéines sériques spécifiques en tant que biomarqueurs qui sont discriminatoires à la cirrhose du foie et le carcinome hépatocellulaire (CHC) patients. Différent de l'expérience 1, dans lequel un seul échantillon de sérum a été appliqué sur tous les sous-réseaux et sondé avec différentes lectines, dans cet essai, le total des 40 différents échantillons de sérum de patients CHC et la cirrhose ont été appliquées sur chaque sous-réseau, et sondé avec une lectine (AAL ). L'analyse statistique, tels que le test T, le récepteur-caractéristique de fonctionnement (ROC), a été fait pour évaluer les distributions ou les performances diagnostiques de l'epiptope glycane / biomarqueur sur chaque protéine individuelle dans tous les échantillons de sérum. Nous avons utilisé la puce même anticorps fabriqués dans l'expérience 1, sauf pour l'anti-CA19-9 et anti-Lewis anticorps X dans cette étude. Le expertiseiment a été réalisée à partir de Sept 2 à l'étape 9, sauf pour l'étape 5.1.1 et 6.1.1. Total des 40 échantillons de sérum à partir de 20 cirrhose et 20 patients HCC ont été appliqués à sous-réseau aléatoire des sous-réseaux 48 ainsi que les échantillons de contrôle CPE comme contrôle négatif. Fucosylation de chaque protéines des saisies a ensuite été détecté en utilisant biotinylé Fucose-lectine spécifique. L'image microarray illustré à la figure 1 a démontré l'AAL lectine ne se lie aux protéines sériques capturés sur la puce (figure 2D) au lieu d'anticorps capturés (figure 2E). Les intensités AAL de liaison de tous les points ont ensuite été extraites et analysées en utilisant le test T et les courbes ROC pour évaluer la performance de la fucosylation (AAL intensité contraignante) de chaque protéine du sérum sur la discrimination entre le HCC et les groupes de cirrhose. Les résultats ont montré que la protéine GP73 fucosylation de donné la meilleure discrimination entre les deux groupes avec un p = 0,03 et l'aire sous-courbe de la courbe ROC est égal à 0,72. Cette expérience a démontré cette procédure est une méthode rapide, efficace pour le glycane épitope / biomarqueur de dépistage sur des échantillons multiples au sein de multiples protéines.

ID	Nom du réactif	Abréviation	Entreprise	Catalogue #
L1	Biotinylé concanavaline A	ConA	Vector Laboratories	BK-1000
L2	Biotinylé Sambucus Nigra Lectin	SCN	Vector Laboratories	B-1305
L3	Biotinylé Lens culinaris Agglutinin	LCA	Vector Laboratories	BK-2000
L4	Biotinylés agglutinine de Ricinus communis, je	RCA	Vector Laboratories	BK-1000
L5	Biotinylé Aleuria Aurantia Lectin	AAD	Vector Laboratories	B-1395
L6	Biotinylé Erythrina cristagalli Lectin	ECL	Vector Laboratories	BK-3000
L7	Biotinylé Griffonia (Bandeiraea) Lectin Simplicifolia II	GSL II	Vector Laboratories	BK-3000
L8	Biotinylé de germe de blé Agglutinin	WGA	Vector Laboratories	BK-1000
L9	Biotinylé Erythroagglutinin Phaseolus vulgaris	PHA-E	Vector Laboratories	BK-2000
L10	Biotinylé Leucoagglutinin Phaseolus vulgaris	PHA-L	Vector Laboratories	BK-2000
L11	BioAgglutinin arachide tinylated	PNA	Vector Laboratories	BK-1000
L12	Biotinylés Pisum sativum Agglutinin	PSA	Vector Laboratories	BK-2000
L13	Biotinylé Dolichos biflorus Agglutinin	DBA	Vector Laboratories	BK-1000
L14	Biotinylé Lectin Datura stramonium	DSL	Vector Laboratories	BK-3000
L15	Biotinylé Sophora japonica Agglutinin	ASJ	Vector Laboratories	BK-2000
L16	Agglutinine du soja biotinylé	SBA	Vector Laboratories	BK-1000
L17	Biotinylé Solanum tuberosum (pomme de terre) Lectin	STL	Vector Laboratories	BK-3000
L18	Biotinylé Lectin Griffonia Simplicifolia (Bandeiraea) Je	GSL, je	Vector Laboratories	BK-2000
L19	Biotinylé Vicia villosa Lectin	VVL	Vector Laboratories	BK-2000
L20	Biotinylé Lycopersicon esculentum (tomate) Lectin	LIE	Vector Laboratories	BK-3000
L21	Ulex biotinylé Europaeus Agglutinin je	UEA I	Vector Laboratories	BK-1000
L22	Biotinylé jacaline	Jacaline	Vector Laboratories	BK-3000
A1	F de chèvre (ab ') 2 Fragment IgM anti-humain, un anticorps Fc5μ	IgM	Jackson Immuno Research	109-006-129
A2	Ane F (ab ') 2Frag anti-IgG humaine (H + L) antibody	AB1	Jackson Immuno Research	709-006-149
A3	Souris anti-IgG humaine F (ab ') 2 d'anticorps monoclonal	AB3	Jackson Immuno Research	209-005-097
A4	De chèvre anti-anticorps humain alpha macroglobuline 2 polyclonal	A2M	GeneTex	GTX62924
A5	De lapin anti-alpha humain-1-antitrypsine d'anticorps polyclonaux	A1AT	Lee Biosiences	CA1T-80A
A6	Souris anti-humaine alpha-1-antitrypsine anticorps monoclonal	A1AT	Sigma-Aldrich	SAB4200198
A7	De lapin anti-alpha humain-1-antitrypsine d'anticorps polyclonaux	AGIR	NeoMarkers	RB-367-A1
A8	De lapin anti-humain alpha-1-antiquehymotrypsin anticorps polyclonal	AGIR	Fisher Scientific	RB9213R7
A9	Souris anti-transferrine humaine d'anticorps monoclonal	La transferrine	GeneTex	GTX101035
A10	De lapin anti-transferrine humaine d'anticorps polyclonaux	La transferrine	GeneTex	GTX77130
A11	De chèvre anti-humain apolipoprotéine J anticorps polyclonaux	ApoJ	Abcam	ab7610
A12	De souris anti-humaine GP73 anticorps monoclonal	GP73	Abbott	14H4-23
A13	De souris anti-humaine GP73 anticorps monoclonal	GP73	Santa Cruz Biotechnology INC	sc-101275
A14	De lapin anti-humain alpha-1 foetoprotéine anticorps polyclonaux	AFP	GenWay	GWB-41C966
A15	Souris anti-humaine alpha-1 foetoprotéine anticorps monoclonal	AFP	Fitzgerald	10-A05A
A16	Souris anti-humaine hémopexine anticorps monoclonal	Hemopexin	Assaypro	60190-05011
A17	Souris anti-humaine glypicane-3 (1G12) anticorps monoclonal	GPL3	Santa Cruz Bio	sc-65443
A18	Souris anti-humaine kininogène (LMW) anticorps monoclonal	Kininogène	Assaypro	20333-05011
A19	De lapin anti-humain MMP-21 anticorps monoclonal	MMP21	Epitomic	1955-1
A20	Souris anti-humaine CEACAM-1 anticorps monoclonal	CEACAM	R & D Systems	MAB1180
Une21	Rat anti-humaine DPPIV/cd26 anticorps monoclonal	DPPIV	R & D Systems	MAB22441
A22	Souris anti-humaine PIVKA II anticorps monoclonal	PIVICA	Cristal chem	8040
A23	Souris anti-antigène carcino-embryonnaire	CEA	US biologique	C1300
A24	Antigène de souris anti-CA125 cancer	CA125	US biologique	C0050-01D
A25	Souris anti-CA19-9 du cancer antigène	CA19-9	US biologique	C0075-18
A26	Souris anti-Lewis x anticorps monoclonal	X Lewis	Calbiochem	434631
bio	Biotinylé BSA (contrôle positif)	Bio	Home-made	N / A

Tableau 1. Liste des lectines et les anticorps utilisés dans ce protocole.

Nom de / du réactif s équipements	Entreprise	Numéro de catalogue
Microarrayer sans contact	BioDot Inc	sciFLEXARRAYER
384 microplaques	Pêcheur	14-230-243
FoodSaver	FoodSaver	V3835
Ultrathin nitrocellulose Coate microarray glisse	Gentel	PATH
Diapositive impression (en option)	La Société Gel	WSP60-1
Shaker	Pêcheur	15-453-211
Centrifuger	Eppendorf	5804 000.013
Faites glisser lavabo / Slide bac à coloration wie Rack	Pêcheur	08-812
Incubation des lames diapositive boîte de chambre / microscope	Pêcheur	03-448-5
Brij 35, solution à 30% p / v dans l'eau	Acros Organics	AC32958-0025
Tween-20	Pêcheur	P337-100
Periodate de sodium (NaIO 4)	Sigma	311448
L-acide glutamique γ-hydrazide	Sigma	G-7257
Acétate de sodium anhydre (CH 3 COONa)	Sigma	S2889
Bovine Serum Albumin (BSA)	Lampire Labs biologique	7500804
Tampon phosphate salin (PBS) (10X)	Denville scientifique	CP4390-48
Dylight 549 neutravidine conjugué	Thermo	22837
Comprimés inhibiteurs de la protéase à cocktails	Roche	4693159001
ChromPure IgG humaine, fragment Fc	Jackson Immunoresearch	009-000-008
ChromPure IgG humaine, molécule entière	Jackson Immunoresearch	009-000-003
ChromPure IgG de souris, molécule entière	Jackson Immunoresearch	015-000-003
ChromPure IgG de souris, le fragment Fc	Jackson Immunoresearch	015-000-008
ChromPure IgG de lapin, molécule entière	Jackson Immunoresearch	011-000-003
ChromPure âne IgG, molécule ensemble	Jackson Immunoresearch	017-000-003
Microarray Scanner	Tecan	LS Reloaded

Tableau 2. Listedes équipements et des réactifs utilisés dans le présent protocole.

Schéma 1 Un schéma montrant la puce anticorps lectine fondée processus de découverte de biomarqueurs glycane 1 (étape 2 à 4): Bloquer le microréseau d'anticorps avec le bloqueur (Glu-hydrazide) et de la BSA, 2 (étape 5):.. S'appliquent échantillons de sérum et de capturer glycoprotéines spécifiques avec des anticorps spécifiques, 3 (étape 6): appliquer lectine biotinylée (s), 4 (étape 7): la sonde de l'AAL biotinylé avec Dylight 549 neutravidine étiqueté pour microréseau d'imagerie.

Figure 1. Images de puces à ADN de l'échantillon le profilage Expérience glycosylation 1 de multiples glycoprotéines sériques dans l'échantillon de sérum du patient CHC en utilisant chemicallié bloquée microréseau d'anticorps avec détection lectine multiples. Deux lames microarray identiques, (A) aucune chimiquement bloqué, ou (B) chimiquement bloqué comme décrit dans l'étape 2, à la fois est passé par toutes les étapes de 2 à 9 pour le profilage de glycosylation, ainsi que des fins de comparaison. (A) et (B) sont les images de microréseaux scanné à l'étape 8, dans une résolution de 10 microns. (C) le zoom dans l'image des deux premières lignes de la diapositive bloquée chimiquement aucune puce à ADN (A); (D) le zoom dans l'image des deux premières rangées de la diapositive non chimiquement puces bloqué (B)); (E) le schéma de l'agencement d'anticorps au sein de chaque sous-réseau; (F) des cartes du tableau: l'emplacement de chaque anticorps dans le sous-tableau, chaque nom d'anticorps représente 3 points; (G) et l'emplacement échantillon de sérum lectine: une montre le schéma qui sous-tableau de chaque échantillon de sérum et lectine a été appliqué sur.

Figure 2. Images de puces à ADN de laexpérience échantillon de 2 écran pour fucosylation altérée sur glycoprotéines sériques spécifiques en tant que biomarqueurs qui sont discriminatoires à la cirrhose du foie et les patients HCC. Le dosage microarray a été réalisée comme décrit dans l'expérience l'échantillon 2 de l'article. (A) L'image diapositive ensemble de la diapositive microréseau de l'étape 8; (B) le schéma de l'agencement d'anticorps au sein de chaque sous-réseau; (C) des cartes de type tableau: l'emplacement de chaque anticorps dans le sous-tableau, chaque nom d'anticorps représente 3 points; (D) un zoom avant sur l'image d'un sous-matrice qui ont été mis à incuber avec un échantillon de sérum; (E) un zoom en une image de sous-matrice qui ont été incubés avec du PBS de commande.

Figure 3. Résultats du profilage des glycanes de 1 expérience de l'échantillon. Chaque diagramme représentent le profil de liaison de lectine (ou profilés glycane) de l'un de la protéine 20 testée. Total des 22 lectines différentes ont été utilisées pour analyser les ee glycane le profil de chaque protéine.

Discussion

1. Protéine cible et la sélection d'anticorps de capture

Avant le dosage d'anticorps microarray, certains réactifs et matériels sont nécessaires pour être considéré et préparé. Pour concevoir un microréseau d'anticorps pour le profilage ou le dépistage des biomarqueurs glycane glycane, un panel d'anticorps spécifiques aux candidats glycoprotéine devrait être déterminée en fonction de la littérature ou à partir des résultats précédents. Ces anticorps ont été généralement achetés ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
ID	Nom du réactif	Abréviation	Entreprise	Catalogue #
L1	Biotinylé concanavaline A	ConA	Vector Laboratories	BK-1000
L2	Biotinylé Sambucus Nigra Lectin	SCN	Vector Laboratories	B-1305
L3	Biotinylé Lens culinaris Agglutinin	LCA	Vector Laboratories	BK-2000
L4	Biotinylés agglutinine de Ricinus communis, je	RCA	Vector Laboratories	BK-1000
L5	Biotinylé Aleuria Aurantia Lectin	AAD	Vector Laboratories	B-1395
L6	Biotinylé Erythrina cristagalli Lectin	ECL	Vector Laboratories	BK-3000
L7	Biotinylé Griffonia (Bandeiraea) Lectin Simplicifolia II	GSL II	Vector Laboratories	BK-3000
L8	Biotinylé de germe de blé Agglutinin	WGA	Vector Laboratories	BK-1000
L9	Biotinylé Erythroagglutinin Phaseolus vulgaris	PHA-E	Vector Laboratories	BK-2000
L10	Biotinylé Leucoagglutinin Phaseolus vulgaris	PHA-L	Vector Laboratories	BK-2000
L11	Agglutinin arachide biotinylé	PNA	Vector Laboratories	BK-1000
L12	Biotinylés Pisum sativum Agglutinin	PSA	Vector Laboratories	BK-2000
L13	Biotinylé Dolichos biflorus Agglutinin	DBA	Vector Laboratories	BK-1000
L14	Biotinylé Lectin Datura stramonium	DSL	Vector Laboratories	BK-3000
L15	Biotinylé Sophora japonica Agglutinin	ASJ	Vector Laboratories	BK-2000
L16	Agglutinine du soja biotinylé	SBA	Vector Laboratories	BK-1000
L17	Biotinylé Solanum tuberosum (pomme de terre) Lectin	STL	Vector Laboratories	BK-3000
L18	Biotinylé Griffonia (bandeeiraea) Simplicifolia Lectin je	GSL, je	Vector Laboratories	BK-2000
L19	Biotinylé Vicia villosa Lectin	VVL	Vector Laboratories	BK-2000
L20	Biotinylé Lycopersicon esculentum (tomate) Lectin	LIE	Vector Laboratories	BK-3000
L21	Ulex biotinylé Europaeus Agglutinin je	UEA I	Vector Laboratories	BK-1000
L22	Biotinylé jacaline	Jacaline	Vector Laboratories	BK-3000
A1	F de chèvre (ab ') 2 Fragment IgM anti-humain, un anticorps Fc5μ	IgM	Jackson Immuno Research	109-006-129
A2	Ane F (ab ') 2 Frag anti-IgG humaine (H + L) unetibody	AB1	Jackson Immuno Research	709-006-149
A3	Souris anti-IgG humaine F (ab ') 2 d'anticorps monoclonal	AB3	Jackson Immuno Research	209-005-097
A4	De chèvre anti-anticorps humain alpha macroglobuline 2 polyclonal	A2M	GeneTex	GTX62924
A5	De lapin anti-alpha humain-1-antitrypsine d'anticorps polyclonaux	A1AT	Lee Biosiences	CA1T-80A
A6	Souris anti-humaine alpha-1-antitrypsine anticorps monoclonal	A1AT	Sigma-Aldrich	SAB4200198
A7	De lapin anti-alpha humain-1-antitrypsine d'anticorps polyclonaux	AGIR	NeoMarkers	RB-367-A1
A8	De lapin anti-humainl'alpha-1-antichymotrypsine anticorps polyclonal	AGIR	Fisher Scientific	RB9213R7
A9	Souris anti-transferrine humaine d'anticorps monoclonal	La transferrine	GeneTex	GTX101035
A10	De lapin anti-transferrine humaine d'anticorps polyclonaux	La transferrine	GeneTex	GTX77130
A11	De chèvre anti-humain apolipoprotéine J anticorps polyclonaux	ApoJ	Abcam	ab7610
A12	De souris anti-humaine GP73 anticorps monoclonal	GP73	Abbott	14H4-23
A13	De souris anti-humaine GP73 anticorps monoclonal	GP73	Santa Cruz Biotechnology INC	sc-101275
A14	De lapin anti-humain alpha-1 fetoprotein anticorps polyclonal	AFP	Genway	GWB-41C966
A15	Souris anti-humaine alpha-1 foetoprotéine anticorps monoclonal	AFP	Fitzgerald	10-A05A
A16	Souris anti-humaine hémopexine anticorps monoclonal	Hemopexin	Assaypro	60190-05011
A17	Souris anti-humaine glypicane-3 (1G12) anticorps monoclonal	GPL3	Santa Cruz Bio	sc-65443
A18	Souris anti-humaine kininogène (LMW) anticorps monoclonal	Kininogène	Assaypro	20333-05011
A19	De lapin anti-humain MMP-21 anticorps monoclonal	MMP21	Epitomic	1955-1
A20	Souris anti-humaine-1 CEACAM antibod monoclonaly	CEACAM	R & D Systems	MAB1180
A21	Rat anti-humaine DPPIV/cd26 anticorps monoclonal	DPPIV	R & D Systems	MAB22441
A22	Souris anti-humaine PIVKA II anticorps monoclonal	PIVICA	Cristal chem	8040
A23	Souris anti-antigène carcino-embryonnaire	CEA	US biologique	C1300
A24	Antigène de souris anti-CA125 cancer	CA125	US biologique	C0050-01D
A25	Souris anti-CA19-9 du cancer antigène	CA19-9	US biologique	C0075-18
A26	Souris anti-Lewis x anticorps monoclonal	X Lewis	Calbiochem	434631
bio	Biotinylé BSA (contrôle positif)	Bio	Home-made	N / A

Nom de / du réactif s équipements	Entreprise	Numéro de catalogue
Microarrayer sans contact	BioDot Inc	sciFLEXARRAYER
384 microplaques	Pêcheur	14-230-243
FoodSaver	FoodSaver	V3835
Ultrathin nitrocellulose Coate microarray glisse	Gentel	PATH
Diapositive impression (en option)	La Société Gel	WSP60-1
Shaker	Pêcheur	15-453-211
Centrifuger	Eppendorf	5804 000.013
Glissez à laver la vaisselle coloration bassin / Slide avec rack amovible	Pêcheur	08-812
Incubation des lames diapositive boîte de chambre / microscope	Pêcheur	03-448-5
Brij 35, solution à 30% p / v dans l'eau	Acros Organics	AC32958-0025
Tween-20	Pêcheur	P337-100
Periodate de sodium (NaIO 4)	Sigma	311448
L-acide glutamique γ-hydrazide	Sigma	G-7257
Acétate de sodium anhydre (CH 3 COONa)	Sigma	S2889
Bovine Serum Albumin (BSA)	Lampire Labs biologique	7500804
Tampon phosphate salin (PBS) (10X)	Denville scientifique	CP4390-48
Dylight 549 neutravidine conjugué	Thermo	22837
Comprimés inhibiteurs de la protéase à cocktails	Roche	4693159001
ChromPure IgG humaine, fragment Fc	Jackson Immunoresearch	009-000-008
ChromPure IgG humaine, molécule entière	Jackson Immunoresearch	009-000-003
ChromPure IgG de souris, molécule entière	Jackson Immunoresearch	015-000-003
ChromPure IgG de souris, le fragment Fc	Jackson Immunoresearch	015-000-008
ChromPure IgG de lapin, molécule entière	Jackson Immunoresearch	011-000-003
ChromPure âne IgG, molécule ensemble	Jackson Immunoresearch	017-000-003
Microarray Scanner	Tecan	LS Reloaded