Dans cette étude, nous décrivons un protocole amélioré pour une puce anticorps à haut débit multiplexées avec la méthode de détection lectine qui peut être utilisé dans le profilage de glycosylation des protéines spécifiques. Ce protocole propose de nouveaux réactifs fiables et réduit considérablement le temps, le coût et les besoins en équipement de laboratoire par rapport à la procédure précédente.
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Article de méthode
Microarray Anticorps chimiquement bloqué pour multiplexée à haut débit de profilage de glycosylation des protéines spécifiques dans les échantillons complexes
Dans cet article
Résumé
Résumé
Dans cette étude, nous décrivons un protocole efficace destiné à un microdispositif d'anticorps multiplexé à haut débit avec détection par protéines liant les glycanes, permettant le profilage de la glycosylation de protéines spécifiques. La glycosylation des protéines est la modification post-traductionnelle la plus répandue sur les protéines, et entraîne des modifications diversifiées de leurs propriétés physiques, chimiques et biologiques. Étant donné que les mécanismes de glycosylation sont particulièrement sensibles à la progression des maladies et aux transformations malignes, une glycosylation anormale a été reconnue comme biomarqueur de détection précoce du cancer et d'autres maladies. Toutefois, les méthodes actuelles d'étude de la glycosylation des protéines sont généralement trop complexes ou coûteuses pour être utilisées dans la plupart des laboratoires courants ou des contextes cliniques, d'où la nécessité d'une méthode plus pratique. Le nouveau protocole décrit dans cette étude utilise un microdispositif d'anticorps chimiquement bloqué avec détection par protéines liant les glycanes (PLG) et réduit considérablement le temps, le coût et les besoins en équipement de laboratoire pour l'étude de la glycosylation des protéines. Dans cette méthode, plusieurs anticorps spécifiques des glycoprotéines immobilisés sont imprimés directement sur les lames de microdispositif, et les N-glycanes présents sur les anticorps sont bloqués. Les anticorps spécifiques des glycoprotéines bloqués et immobilisés sont alors capables de capturer et d'isoler des glycoprotéines à partir d'un échantillon complexe appliqué directement sur les lames de microdispositif. La détection des glycanes peut ensuite être réalisée par l'application de lectines biotinylées et d'autres PLG sur la lame de microdispositif, tandis que les niveaux de liaison peuvent être déterminés à l'aide de streptavidine Dylight 549. Grâce à l'utilisation d'un panel d'anticorps et à la sonde avec plusieurs lectines biotinylées, cette méthode permet d'établir un profil de glycosylation efficace des différentes protéines présentes dans un échantillon humain ou animal donné.
Introduction
La glycosylation des protéines, qui est la modification post-traductionnelle la plus répandue sur les protéines, modifie les propriétés physiques, chimiques et biologiques d'une protéine et joue un rôle fondamental dans divers processus biologiques1-6. Étant donné que la machinerie de glycosylation est particulièrement sensible à la progression de la maladie et à la transformation maligne, une glycosylation anormale a été reconnue comme un biomarqueur de détection précoce du cancer et d'autres maladies. 7-12. En effet, la plupart des biomarqueurs tumoraux actuels, tels que la fraction L3 de α-1 fœtoprotéine (AFP) pour le carcinome hépatocellulaire 13-15et CA199 pour le cancer du pancréas 16, 17 sont tous des motifs glucidiques anormaux présents sur les glycoprotéines. Toutefois, les méthodes d'étude de la glycosylation des protéines se sont révélées complexes et inadaptées aux laboratoires de routine et aux contextes cliniques. Chen et al. a récemment mis au point un microréseau d'anticorps chimiquement bloqué associé à une méthode de détection par protéines liant les glycanes (GBP) permettant le profilage, à haut débit et en multiplex, de la glycosylation de glycoprotéines natives dans un échantillon complexe 18. Dans cette méthode de puces à ADN basée sur l'affinité, de multiples anticorps spécifiques des glycoprotéines immobilisés capturent et isolent directement les glycoprotéines à partir d'un mélange complexe sur la lame de puces, et les glycanes associés à chaque protéine capturée individuellement sont mesurés à l'aide de GBP. Étant donné que tous les anticorps normaux contiennent des N-glycanes pouvant être reconnus par la plupart des GBP, l'étape cruciale de cette méthode consiste à bloquer chimiquement les glycanes présents sur les anticorps afin d'empêcher leur liaison aux GBP. Dans la procédure, les cisLes groupes -diol des glycanes présents sur les anticorps ont d'abord été oxydés en groupes aldéhyde à l'aide de NaIO₄.4 dans un tampon d'acétate de sodium en évitant la lumière. Les groupes aldéhyde ont ensuite été conjugués au groupe hydrazide d'un agent de liaison croisée, le chlorure d'acide 4-(4-N-maleimidophényl)butyrique hydrazide (MPBH), suivi de la conjugaison d'un dipeptide, Cys-Gly, au groupe maléimide du MPBH. Ainsi, les groupes cis-diol des glycanes des anticorps ont été convertis en groupes volumineux non hydroxyles, ce qui entrave la liaison des lectines et autres GBP aux anticorps de capture. Cette procédure de blocage permet aux GBP et aux lectines de ne se lier qu'aux glycanes des protéines capturées. Après ce blocage chimique, les échantillons sériques ont été incubés avec la matrice d'anticorps, suivis par la détection des glycanes à l'aide de différentes lectines et GBP biotinylées, puis visualisés avec la streptavidine-Cy3. L'utilisation parallèle d'un ensemble d'anticorps et de plusieurs sondes de lectines fournit des profils de glycosylation distincts pour de multiples protéines dans un échantillon donné 18-20. Cette méthode a été utilisée avec succès dans plusieurs laboratoires différents 1, 7, 13, 19-31Cependant, la stabilité du MPBH et du Cys-Gly, ainsi que la procédure complexe et longue de cette méthode, affectent la reproductibilité, l'efficacité et le rendement de la méthode. Dans ce nouveau protocole, nous avons remplacé à la fois le MPBH et le Cys-Gly par un réactif beaucoup plus stable, l'hydrazide de l'acide glutamique (Glu-hydrazide), ce qui a considérablement amélioré la reproductibilité de la méthode et simplifié et raccourci l'ensemble de la procédure, de sorte qu'elle peut être réalisée en une seule journée de travail. Dans ce nouveau protocole, nous décrivons la procédure détaillée, facilement adoptable par les laboratoires courants pour l'étude de routine de la glycosylation des protéines, ainsi que les techniques nécessaires pour obtenir des résultats reproductibles et reproductibles.
Protocole
1. Imprimer une Microarray Anticorps pour le test
- Diluer tous les anticorps à 0,5 mg / ml dans une solution saline de tampon phosphate, pH 7,2 (PBS).
- Aliquoter 40 ul de chaque anticorps dans la plaque de source de 384 puits.
- Charger la plaque de source de 384 puits sur le microarrayer sciFLEXARRAYER Scienion.
- Chargez 20 diapositives microarray PATH sur le microarrayer en tant que cible.
- Réglez le microarrayer d'imprimer 48 sous-réseaux identiques, dans lequel 27 anticorps et les protéines de contrôle sont repérés en triple exemplaire dans un modèle 9x9 (figure 1E, 1F).
- Démarrez le microarrayer d'imprimer les diapositives biopuces d'anticorps.
- Recueillir les diapositives biopuces d'anticorps, et de les stocker dans la cassette diapositives avec déshydratant. Passez l'aspirateur sceller la cassette dans un sac en plastique à l'aide de vide scellant (Foodsaver).
- Rangez les lames microarray scellées à 4 ° C au réfrigérateur.
2. Chimiquement Bloquer le Microarray Anticorps visant à prévenir GBPLier aux anticorps de capture
Le test commence une fois que les puces à ADN microarray diapositives sont chimiquement bloqué et dure environ 8 heures. Une fois démarré l'essai microarray doit être complété (étapes 2 à 8).
- Prenez la puce se glisse hors du réfrigérateur, et de les amener à température ambiante pendant 30 minutes.
- Retirer la lame de la boîte de rangement et brièvement les rincer à pH tampon phosphate salin à 7,2 avec 0,1% de Tween 20 (PBST0.1) une fois dans une diapositive lavabo, puis dans 15 mM, pH tampon acétate de sodium 5,0 avec 0,1% (Tween CBT0 0.1) d'une manière séquentielle. Incuber les lames dans CBT0.1 pendant 10 minutes dans le bassin de lavage diapositive.
- Préparer une nouvelle solution 150 mM NaIO 4 à 15 mM de tampon acétate de sodium pH 5,0 (CB), et conservez-le dans dans une diapositive lavabo dans un réfrigérateur tout en évitant la lumière avant de l'utiliser.
- Retirer la lame de la CB, et le mettre dans le bassin contenant frais NaIO 4 avec le côté d'anticorpsvers le haut. Couvrez le bassin avec une feuille d'aluminium pour éviter la lumière, et incuber le bassin diapositive pendant 2 heures avec agitation douce à 4 ° C dans un réfrigérateur.
- Préparer 300 ml de 10 mM d'acide glutamique hydrazide (le bloqueur) dans CB.
- Retirer la lame du bassin, et brièvement le rincer à CB 3 fois pendant 5 minutes à chaque fois dans le bassin de lavage diapositive.
- Incuber les lames dans le bloqueur dans un bassin de lavage pour 2 heures à température ambiante sous agitation douce.
- Retirer les lames du bassin, et les laver avec PBST0.1 pendant 3 minutes.
3. Bloc non-spécifiques de liaisons pour la micropuce de la sérumalbumine bovine (BSA)
- Préparer 300 ml de BSA 1% dans du tampon phosphate pH 7,2 avec une solution saline à 0,5% de Tween (PBST0.5) dans un bassin de lavage coulisseau, et incuber le coulisseau microréseau dans le bassin pendant 1 heure à température ambiante avec agitant doucement.
- Rincer les lames dans PBST0.1 trois fois pendant 3 minutes à chaque fois.
- Mettre la diapositivesur une grille coulissante, et tournent à 1200 xg sur une centrifugation pendant 2 minutes pour sécher la lame puces à ADN.
4. Grille de cire Mentions légales sur la lame de puces à ADN pour séparer chaque sous-réseau
- Préchauffer le dispositif d'impression de cire à 70 ° C pendant 5 minutes.
- Charger le coulisseau microréseau bloquée dans le dispositif d'impression de la cire avec le côté faisant face à l'anticorps de la cire. Tirez doucement sur la poignée à la cire empreinte sur la lame régulièrement.
5. Appliquer échantillons de sérum sur la lame de puces à ADN
- Lors de l'étape 2.4, la préparation des échantillons de sérum pour dosage soit profilage glyco dans un échantillon (5.1.1), ou simple glyco epiptope mesures parmi plusieurs échantillons (5.1.2).
- Dans une expérience pour les profilages glycanniques de plusieurs glycoprotéines sériques dans un échantillon de sérum en utilisant plusieurs Gbps (voir 1 expérience de l'échantillon), un des échantillons de sérum sera appliquée sur tous les sous-réseaux. Dans ce cas, 40 pl amplement le sérum est dilué dans pl 360 de PBS contenant 0,1%Tween-20, 0,1% Brij 35, 100 ug / ml de IgG de souris, 100 ug / ml de IgG de rat, 100 ug / ml de IgG de lapin, 100 ug / ml de IgG de chèvre et de 100 pg / ml d'âne IgG. Ce volume est suffisant pour l'application de 6 pi de solution de sérum dilué sur chaque sous-réseau.
- Dans une expérience pour la mesure d'une glycane sur plusieurs protéines sériques entre plusieurs échantillons de sérum en utilisant un détections GBP (voir 2 l'expérience de l'échantillon). Dans ce cas, 1 pl amplement sérum est dilué dans 9 ul de PBS contenant 0,1% de Tween-20, 0,1% Brij 35, 100 ug / ml de IgG de souris, 100 ug / ml de IgG de rat, 100 ug / ml de IgG de lapin , 100 ug / ml de IgG de chèvre et 100 pg / ml d'âne IgG. Ce volume est suffisant pour l'application de 6 pi de solution de sérum dilué sur chaque sous-réseau.
- Après empreinte de cire à l'étape 4, appliquez soigneusement 6 pi d'échantillon dilué ou des échantillons de contrôle (PBST0.1) à chaque sous-tableau de la diapositive. Incuber la lame dans une cassette humidifié avec du papier absorbant humide à la température ambiantependant 1 heure.
- Rincer la lame avec PBST0.1 trois fois pendant 3 minutes à chaque fois.
- Sécher la lame en le tournant à 1200 xg pendant 2 minutes.
6. Appliquer biotinylé GBP (Anticorps anti-lectine ou glycane) sur la glissière
- Lors de l'étape 2.4, préparer des lectines biotinylées 10μg/ml ou Gbps en PBST0.1.
- Dans l'expérience de profilage glycane que la sonde un échantillon avec des lectines multiples (1 expérience de l'échantillon), préparer 350 pi de lectine biotinylée qui est suffisant pour tous les sous-réseaux.
- En simple glycane épitope / biomarqueur de dépistage dans de multiples échantillons en utilisant des lectines multiples, préparer 10 ul de chaque lectine biotinylée qui est suffisant pour un sous-réseau.
- Appliquer 6 pl de la lectine biotinylée dilué (s) à chaque sous-tableau de la diapositive, et incuber dans la boîte de diapositive humidifié avec du papier absorbant humide à température ambiante pendant 1 heure.
- Rincer les lames avec PBST0.1 trois fois pendant 3 minutes de chaque timoi.
- Sécher la lame en le tournant à 1200 xg dans une centrifugeuse pour 2 minutes.
7. Appliquer de la teinture neutravidine Étiqueté pour la détection par fluorescence
- Préparer 350 pi de Dylight 549 neutravidine étiqueté qui est suffisant pour tous les sous-réseaux.
- Appliquer 6 pi de Dylight 549 neutravidine marqué sur chaque sous-réseau, et incuber la lame dans la cassette diapositive humide à température ambiante pendant 1 heure.
- Rincer la lame avec PBST0.1 trois fois pendant 3 minutes à chaque fois.
- Sécher la lame en faisant tourner la il à 1200 xg dans une centrifugeuse pour 2 minutes.
8. Obtenir image de la diapositive Microarray par balayage de la diapositive
- Numérisation de la diapositive en utilisant un scanner de fluorescence à puce une résolution de 10 um. Les paramètres du laser et PMT devrait être aussi fort que possible, mais pas de point de saturation est observée.
9. Extraction et analyse des données
- Ouvrez l'image dans ArrayPro 3.2.
- Mettre en place le modèle réseau selon la carte réseau qui montre les taches d'anticorps endroits. Alignez soigneusement chaque cercle gabarit sur l'endroit correspondant dans l'image.
- Extrait de l'intensité de chaque spot dans un fichier Excel pour une analyse plus approfondie.
10. Les résultats représentatifs
1 Exemple d'expérience
La glycosylation de profilage plusieurs glycoprotéines sériques dans l'échantillon du patient carcinome hépatocellulaire sérum en utilisant des anticorps microarray chimiquement bloqué avec détection des lectines multiples.
Le but de cette expérience est d'explorer le profil de glycosylation des glycoprotéines individuelle de 20 dans le carcinome hépatocellulaire (HCC) de l'échantillon de sérum du patient à l'aide de puces à ADN d'anticorps chimiquement bloqué avec détection de lectine. Une puce à ADN d'anticorps, qui contient 48 sous-réseaux identiques qui comprennent 26 anticorps et la biotine-BSA, a été conçu et fabriqué comme décrit dans Step 1. Ces anticorps étaient 26 contre 20 glycoprotéines sériques que identifiés comme prometteurs valeur diagnostic précoce pour les patients HCC en utilisant la lectine immunoprécipitation combinée avec des l'identification des protéines par spectrométrie de masse 12, 32 comme indiqué dans le tableau 1. Le motif et l'agencement des points imprimés en triple anticorps dans un sous-matrice représentant sont représentés à la figure 1E et 1F, respectivement. Deux lames microarray identiques, on n'était pas bloqué chimiquement (figure 1A), tandis que l'autre a été (figure 1B), ont été utilisés pour réaliser l'expérience de glycosylation même profilage afin de démontrer l'importance de la procédure de blocage chimiquement à l'analyse. Pour la diapositive chimiquement bloqué (figure 1B), l'expérience a commencé à l'étape 2, car il n'en diapositive chimiquement bloqué (figure 1A), l'expérience a débuté à l'étape 3. L'expérience a été réalisée par following toutes les étapes décrites dans le protocole, sauf pour l'étape 5.1.2 et 6.1.2. Dans l'étape 5.2, un échantillon de contrôle PBST0.1 a été appliqué sur sous-réseaux dans la colonne 1 et 3, et une mise en commun HCC échantillon de sérum a été appliqué sur sous-réseaux dans la colonne 2 et 4, respectivement (comme le montre la figure 1G). Cette comparaison est de montrer l'efficacité, l'efficience de la procédure, ainsi que l'affinité de liaison d'antigène des anticorps après chimiquement blocage. 22 lectines biotinylées (comme indiqué dans le tableau 1) que spécifique à différents glycanes 18, 20 ont été appliquées sur chaque sous-réseau comme le montre la figure 1G pour le profilage de glycosylation. Images des chimiquement bloqués (figure 1B) et non-chimiquement bloqué (figure 1A) puces après le dosage de profilage glycosylation en suivant le protocole. Comme indiqué dans les sous-réseaux dans la colonne 1 et 3 dans les pays non-chimiquement puces bloquées (figure 1A et figure 1C), sur lequelseulement PBST0.1 a été appliqué, la plupart des lectines lié à anticorps de capture, et a montré de fond très élevé que ces sous-réseaux comparables à la colonne 2 et 4, sur lequel l'échantillon de sérum a été appliquée. Il est impossible d'obtenir des informations de profil glycane à partir de cette diapositive puces à ADN. Au contraire, lorsque la même expérience a été faite sur une diapositive microréseau d'anticorps chimiquement bloqué, les sous-réseaux dans la colonne 1 et 3, sur lequel a été appliqué seulement PBST0.1, la plupart des lectines ont montré les liaisons pas ou très faible pour capturer les anticorps, tandis que l'antigène de haute liaisons étaient encore observées dans les sous-réseaux dans la colonne 2 et 4, sur lequel un échantillon de sérum a été appliquée (figure 1B et 1D). Ces résultats ont montré la procédure de blocage chimiquement était une étape essentielle avant la mesure de glycanes sur des anticorps capturés glycoprotéines. En suivant le protocole, profils de glycosylation des glycoprotéines dans 22 HCC sérum peut être obtenu.
Expérience 2
Écran pour fucos modifiésylation sur glycoprotéines sériques spécifiques comme biomarqueurs pour la cirrhose du foie et de discrimination patients atteints de carcinome hépatocellulaire.
Le but de cette expérience est à l'écran pour fucosylation altérée sur glycoprotéines sériques spécifiques en tant que biomarqueurs qui sont discriminatoires à la cirrhose du foie et le carcinome hépatocellulaire (CHC) patients. Différent de l'expérience 1, dans lequel un seul échantillon de sérum a été appliqué sur tous les sous-réseaux et sondé avec différentes lectines, dans cet essai, le total des 40 différents échantillons de sérum de patients CHC et la cirrhose ont été appliquées sur chaque sous-réseau, et sondé avec une lectine (AAL ). L'analyse statistique, tels que le test T, le récepteur-caractéristique de fonctionnement (ROC), a été fait pour évaluer les distributions ou les performances diagnostiques de l'epiptope glycane / biomarqueur sur chaque protéine individuelle dans tous les échantillons de sérum. Nous avons utilisé la puce même anticorps fabriqués dans l'expérience 1, sauf pour l'anti-CA19-9 et anti-Lewis anticorps X dans cette étude. Le expertiseiment a été réalisée à partir de Sept 2 à l'étape 9, sauf pour l'étape 5.1.1 et 6.1.1. Total des 40 échantillons de sérum à partir de 20 cirrhose et 20 patients HCC ont été appliqués à sous-réseau aléatoire des sous-réseaux 48 ainsi que les échantillons de contrôle CPE comme contrôle négatif. Fucosylation de chaque protéines des saisies a ensuite été détecté en utilisant biotinylé Fucose-lectine spécifique. L'image microarray illustré à la figure 1 a démontré l'AAL lectine ne se lie aux protéines sériques capturés sur la puce (figure 2D) au lieu d'anticorps capturés (figure 2E). Les intensités AAL de liaison de tous les points ont ensuite été extraites et analysées en utilisant le test T et les courbes ROC pour évaluer la performance de la fucosylation (AAL intensité contraignante) de chaque protéine du sérum sur la discrimination entre le HCC et les groupes de cirrhose. Les résultats ont montré que la protéine GP73 fucosylation de donné la meilleure discrimination entre les deux groupes avec un p = 0,03 et l'aire sous-courbe de la courbe ROC est égal à 0,72. Cette expérience a démontré cette procédure est une méthode rapide, efficace pour le glycane épitope / biomarqueur de dépistage sur des échantillons multiples au sein de multiples protéines.
| ID | Nom du réactif | Abréviation | Entreprise | Catalogue # |
| L1 | Biotinylé concanavaline A | ConA | Vector Laboratories | BK-1000 |
| L2 | Biotinylé Sambucus Nigra Lectin | SCN | Vector Laboratories | B-1305 |
| L3 | Biotinylé Lens culinaris Agglutinin | LCA | Vector Laboratories | BK-2000 |
| L4 | Biotinylés agglutinine de Ricinus communis, je | RCA | Vector Laboratories | BK-1000 |
| L5 | Biotinylé Aleuria Aurantia Lectin | AAD | Vector Laboratories | B-1395 |
| L6 | Biotinylé Erythrina cristagalli Lectin | ECL | Vector Laboratories | BK-3000 |
| L7 | Biotinylé Griffonia (Bandeiraea) Lectin Simplicifolia II | GSL II | Vector Laboratories | BK-3000 |
| L8 | Biotinylé de germe de blé Agglutinin | WGA | Vector Laboratories | BK-1000 |
| L9 | Biotinylé Erythroagglutinin Phaseolus vulgaris | PHA-E | Vector Laboratories | BK-2000 |
| L10 | Biotinylé Leucoagglutinin Phaseolus vulgaris | PHA-L | Vector Laboratories | BK-2000 |
| L11 | BioAgglutinin arachide tinylated | PNA | Vector Laboratories | BK-1000 |
| L12 | Biotinylés Pisum sativum Agglutinin | PSA | Vector Laboratories | BK-2000 |
| L13 | Biotinylé Dolichos biflorus Agglutinin | DBA | Vector Laboratories | BK-1000 |
| L14 | Biotinylé Lectin Datura stramonium | DSL | Vector Laboratories | BK-3000 |
| L15 | Biotinylé Sophora japonica Agglutinin | ASJ | Vector Laboratories | BK-2000 |
| L16 | Agglutinine du soja biotinylé | SBA | Vector Laboratories | BK-1000 |
| L17 | Biotinylé Solanum tuberosum (pomme de terre) Lectin | STL | Vector Laboratories | BK-3000 |
| L18 | Biotinylé Lectin Griffonia Simplicifolia (Bandeiraea) Je | GSL, je | Vector Laboratories | BK-2000 |
| L19 | Biotinylé Vicia villosa Lectin | VVL | Vector Laboratories | BK-2000 |
| L20 | Biotinylé Lycopersicon esculentum (tomate) Lectin | LIE | Vector Laboratories | BK-3000 |
| L21 | Ulex biotinylé Europaeus Agglutinin je | UEA I | Vector Laboratories | BK-1000 |
| L22 | Biotinylé jacaline | Jacaline | Vector Laboratories | BK-3000 |
| A1 | F de chèvre (ab ') 2 Fragment IgM anti-humain, un anticorps Fc5μ | IgM | Jackson Immuno Research | 109-006-129 |
| A2 | Ane F (ab ') 2Frag anti-IgG humaine (H + L) antibody | AB1 | Jackson Immuno Research | 709-006-149 |
| A3 | Souris anti-IgG humaine F (ab ') 2 d'anticorps monoclonal | AB3 | Jackson Immuno Research | 209-005-097 |
| A4 | De chèvre anti-anticorps humain alpha macroglobuline 2 polyclonal | A2M | GeneTex | GTX62924 |
| A5 | De lapin anti-alpha humain-1-antitrypsine d'anticorps polyclonaux | A1AT | Lee Biosiences | CA1T-80A |
| A6 | Souris anti-humaine alpha-1-antitrypsine anticorps monoclonal | A1AT | Sigma-Aldrich | SAB4200198 |
| A7 | De lapin anti-alpha humain-1-antitrypsine d'anticorps polyclonaux | AGIR | NeoMarkers | RB-367-A1 |
| A8 | De lapin anti-humain alpha-1-antiquehymotrypsin anticorps polyclonal | AGIR | Fisher Scientific | RB9213R7 |
| A9 | Souris anti-transferrine humaine d'anticorps monoclonal | La transferrine | GeneTex | GTX101035 |
| A10 | De lapin anti-transferrine humaine d'anticorps polyclonaux | La transferrine | GeneTex | GTX77130 |
| A11 | De chèvre anti-humain apolipoprotéine J anticorps polyclonaux | ApoJ | Abcam | ab7610 |
| A12 | De souris anti-humaine GP73 anticorps monoclonal | GP73 | Abbott | 14H4-23 |
| A13 | De souris anti-humaine GP73 anticorps monoclonal | GP73 | Santa Cruz Biotechnology INC | sc-101275 |
| A14 | De lapin anti-humain alpha-1 foetoprotéine anticorps polyclonaux | AFP | GenWay | GWB-41C966 |
| A15 | Souris anti-humaine alpha-1 foetoprotéine anticorps monoclonal | AFP | Fitzgerald | 10-A05A |
| A16 | Souris anti-humaine hémopexine anticorps monoclonal | Hemopexin | Assaypro | 60190-05011 |
| A17 | Souris anti-humaine glypicane-3 (1G12) anticorps monoclonal | GPL3 | Santa Cruz Bio | sc-65443 |
| A18 | Souris anti-humaine kininogène (LMW) anticorps monoclonal | Kininogène | Assaypro | 20333-05011 |
| A19 | De lapin anti-humain MMP-21 anticorps monoclonal | MMP21 | Epitomic | 1955-1 |
| A20 | Souris anti-humaine CEACAM-1 anticorps monoclonal | CEACAM | R & D Systems | MAB1180 |
| Une21 | Rat anti-humaine DPPIV/cd26 anticorps monoclonal | DPPIV | R & D Systems | MAB22441 |
| A22 | Souris anti-humaine PIVKA II anticorps monoclonal | PIVICA | Cristal chem | 8040 |
| A23 | Souris anti-antigène carcino-embryonnaire | CEA | US biologique | C1300 |
| A24 | Antigène de souris anti-CA125 cancer | CA125 | US biologique | C0050-01D |
| A25 | Souris anti-CA19-9 du cancer antigène | CA19-9 | US biologique | C0075-18 |
| A26 | Souris anti-Lewis x anticorps monoclonal | X Lewis | Calbiochem | 434631 |
| bio | Biotinylé BSA (contrôle positif) | Bio | Home-made | N / A |
Tableau 1. Liste des lectines et les anticorps utilisés dans ce protocole.
| Nom de / du réactif s équipements | Entreprise | Numéro de catalogue |
| Microarrayer sans contact | BioDot Inc | sciFLEXARRAYER |
| 384 microplaques | Pêcheur | 14-230-243 |
| FoodSaver | FoodSaver | V3835 |
| Ultrathin nitrocellulose Coate microarray glisse | Gentel | PATH |
| Diapositive impression (en option) | La Société Gel | WSP60-1 |
| Shaker | Pêcheur | 15-453-211 |
| Centrifuger | Eppendorf | 5804 000.013 |
| Faites glisser lavabo / Slide bac à coloration wie Rack | Pêcheur | 08-812 |
| Incubation des lames diapositive boîte de chambre / microscope | Pêcheur | 03-448-5 |
| Brij 35, solution à 30% p / v dans l'eau | Acros Organics | AC32958-0025 |
| Tween-20 | Pêcheur | P337-100 |
| Periodate de sodium (NaIO 4) | Sigma | 311448 |
| L-acide glutamique γ-hydrazide | Sigma | G-7257 |
| Acétate de sodium anhydre (CH 3 COONa) | Sigma | S2889 |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Lampire Labs biologique | 7500804 |
| Tampon phosphate salin (PBS) (10X) | Denville scientifique | CP4390-48 |
| Dylight 549 neutravidine conjugué | Thermo | 22837 |
| Comprimés inhibiteurs de la protéase à cocktails | Roche | 4693159001 |
| ChromPure IgG humaine, fragment Fc | Jackson Immunoresearch | 009-000-008 |
| ChromPure IgG humaine, molécule entière | Jackson Immunoresearch | 009-000-003 |
| ChromPure IgG de souris, molécule entière | Jackson Immunoresearch | 015-000-003 |
| ChromPure IgG de souris, le fragment Fc | Jackson Immunoresearch | 015-000-008 |
| ChromPure IgG de lapin, molécule entière | Jackson Immunoresearch | 011-000-003 |
| ChromPure âne IgG, molécule ensemble | Jackson Immunoresearch | 017-000-003 |
| Microarray Scanner | Tecan | LS Reloaded |
Tableau 2. Listedes équipements et des réactifs utilisés dans le présent protocole.
Schéma 1 Un schéma montrant la puce anticorps lectine fondée processus de découverte de biomarqueurs glycane 1 (étape 2 à 4): Bloquer le microréseau d'anticorps avec le bloqueur (Glu-hydrazide) et de la BSA, 2 (étape 5):.. S'appliquent échantillons de sérum et de capturer glycoprotéines spécifiques avec des anticorps spécifiques, 3 (étape 6): appliquer lectine biotinylée (s), 4 (étape 7): la sonde de l'AAL biotinylé avec Dylight 549 neutravidine étiqueté pour microréseau d'imagerie.
Figure 1. Images de puces à ADN de l'échantillon le profilage Expérience glycosylation 1 de multiples glycoprotéines sériques dans l'échantillon de sérum du patient CHC en utilisant chemicallié bloquée microréseau d'anticorps avec détection lectine multiples. Deux lames microarray identiques, (A) aucune chimiquement bloqué, ou (B) chimiquement bloqué comme décrit dans l'étape 2, à la fois est passé par toutes les étapes de 2 à 9 pour le profilage de glycosylation, ainsi que des fins de comparaison. (A) et (B) sont les images de microréseaux scanné à l'étape 8, dans une résolution de 10 microns. (C) le zoom dans l'image des deux premières lignes de la diapositive bloquée chimiquement aucune puce à ADN (A); (D) le zoom dans l'image des deux premières rangées de la diapositive non chimiquement puces bloqué (B)); (E) le schéma de l'agencement d'anticorps au sein de chaque sous-réseau; (F) des cartes du tableau: l'emplacement de chaque anticorps dans le sous-tableau, chaque nom d'anticorps représente 3 points; (G) et l'emplacement échantillon de sérum lectine: une montre le schéma qui sous-tableau de chaque échantillon de sérum et lectine a été appliqué sur.
Figure 2. Images de puces à ADN de laexpérience échantillon de 2 écran pour fucosylation altérée sur glycoprotéines sériques spécifiques en tant que biomarqueurs qui sont discriminatoires à la cirrhose du foie et les patients HCC. Le dosage microarray a été réalisée comme décrit dans l'expérience l'échantillon 2 de l'article. (A) L'image diapositive ensemble de la diapositive microréseau de l'étape 8; (B) le schéma de l'agencement d'anticorps au sein de chaque sous-réseau; (C) des cartes de type tableau: l'emplacement de chaque anticorps dans le sous-tableau, chaque nom d'anticorps représente 3 points; (D) un zoom avant sur l'image d'un sous-matrice qui ont été mis à incuber avec un échantillon de sérum; (E) un zoom en une image de sous-matrice qui ont été incubés avec du PBS de commande.
Figure 3. Résultats du profilage des glycanes de 1 expérience de l'échantillon. Chaque diagramme représentent le profil de liaison de lectine (ou profilés glycane) de l'un de la protéine 20 testée. Total des 22 lectines différentes ont été utilisées pour analyser les ee glycane le profil de chaque protéine.
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Discussion
1. Protéine cible et la sélection d'anticorps de capture
Avant le dosage d'anticorps microarray, certains réactifs et matériels sont nécessaires pour être considéré et préparé. Pour concevoir un microréseau d'anticorps pour le profilage ou le dépistage des biomarqueurs glycane glycane, un panel d'anticorps spécifiques aux candidats glycoprotéine devrait être déterminée en fonction de la littérature ou à partir des résultats précédents. Ces anticorps ont été généralement achetés ...
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n'ont rien à révéler.
Remerciements
Ce travail a été soutenu par l'Institut pour l'hépatite et de la recherche de virus.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires | |
|---|---|---|---|---|
| ID | Nom du réactif | Abréviation | Entreprise | Catalogue # |
| L1 | Biotinylé concanavaline A | ConA | Vector Laboratories | BK-1000 |
| L2 | Biotinylé Sambucus Nigra Lectin | SCN | Vector Laboratories | B-1305 |
| L3 | Biotinylé Lens culinaris Agglutinin | LCA | Vector Laboratories | BK-2000 |
| L4 | Biotinylés agglutinine de Ricinus communis, je | RCA | Vector Laboratories | BK-1000 |
| L5 | Biotinylé Aleuria Aurantia Lectin | AAD | Vector Laboratories | B-1395 |
| L6 | Biotinylé Erythrina cristagalli Lectin | ECL | Vector Laboratories | BK-3000 |
| L7 | Biotinylé Griffonia (Bandeiraea) Lectin Simplicifolia II | GSL II | Vector Laboratories | BK-3000 |
| L8 | Biotinylé de germe de blé Agglutinin | WGA | Vector Laboratories | BK-1000 |
| L9 | Biotinylé Erythroagglutinin Phaseolus vulgaris | PHA-E | Vector Laboratories | BK-2000 |
| L10 | Biotinylé Leucoagglutinin Phaseolus vulgaris | PHA-L | Vector Laboratories | BK-2000 |
| L11 | Agglutinin arachide biotinylé | PNA | Vector Laboratories | BK-1000 |
| L12 | Biotinylés Pisum sativum Agglutinin | PSA | Vector Laboratories | BK-2000 |
| L13 | Biotinylé Dolichos biflorus Agglutinin | DBA | Vector Laboratories | BK-1000 |
| L14 | Biotinylé Lectin Datura stramonium | DSL | Vector Laboratories | BK-3000 |
| L15 | Biotinylé Sophora japonica Agglutinin | ASJ | Vector Laboratories | BK-2000 |
| L16 | Agglutinine du soja biotinylé | SBA | Vector Laboratories | BK-1000 |
| L17 | Biotinylé Solanum tuberosum (pomme de terre) Lectin | STL | Vector Laboratories | BK-3000 |
| L18 | Biotinylé Griffonia (bandeeiraea) Simplicifolia Lectin je | GSL, je | Vector Laboratories | BK-2000 |
| L19 | Biotinylé Vicia villosa Lectin | VVL | Vector Laboratories | BK-2000 |
| L20 | Biotinylé Lycopersicon esculentum (tomate) Lectin | LIE | Vector Laboratories | BK-3000 |
| L21 | Ulex biotinylé Europaeus Agglutinin je | UEA I | Vector Laboratories | BK-1000 |
| L22 | Biotinylé jacaline | Jacaline | Vector Laboratories | BK-3000 |
| A1 | F de chèvre (ab ') 2 Fragment IgM anti-humain, un anticorps Fc5μ | IgM | Jackson Immuno Research | 109-006-129 |
| A2 | Ane F (ab ') 2 Frag anti-IgG humaine (H + L) unetibody | AB1 | Jackson Immuno Research | 709-006-149 |
| A3 | Souris anti-IgG humaine F (ab ') 2 d'anticorps monoclonal | AB3 | Jackson Immuno Research | 209-005-097 |
| A4 | De chèvre anti-anticorps humain alpha macroglobuline 2 polyclonal | A2M | GeneTex | GTX62924 |
| A5 | De lapin anti-alpha humain-1-antitrypsine d'anticorps polyclonaux | A1AT | Lee Biosiences | CA1T-80A |
| A6 | Souris anti-humaine alpha-1-antitrypsine anticorps monoclonal | A1AT | Sigma-Aldrich | SAB4200198 |
| A7 | De lapin anti-alpha humain-1-antitrypsine d'anticorps polyclonaux | AGIR | NeoMarkers | RB-367-A1 |
| A8 | De lapin anti-humainl'alpha-1-antichymotrypsine anticorps polyclonal | AGIR | Fisher Scientific | RB9213R7 |
| A9 | Souris anti-transferrine humaine d'anticorps monoclonal | La transferrine | GeneTex | GTX101035 |
| A10 | De lapin anti-transferrine humaine d'anticorps polyclonaux | La transferrine | GeneTex | GTX77130 |
| A11 | De chèvre anti-humain apolipoprotéine J anticorps polyclonaux | ApoJ | Abcam | ab7610 |
| A12 | De souris anti-humaine GP73 anticorps monoclonal | GP73 | Abbott | 14H4-23 |
| A13 | De souris anti-humaine GP73 anticorps monoclonal | GP73 | Santa Cruz Biotechnology INC | sc-101275 |
| A14 | De lapin anti-humain alpha-1 fetoprotein anticorps polyclonal | AFP | Genway | GWB-41C966 |
| A15 | Souris anti-humaine alpha-1 foetoprotéine anticorps monoclonal | AFP | Fitzgerald | 10-A05A |
| A16 | Souris anti-humaine hémopexine anticorps monoclonal | Hemopexin | Assaypro | 60190-05011 |
| A17 | Souris anti-humaine glypicane-3 (1G12) anticorps monoclonal | GPL3 | Santa Cruz Bio | sc-65443 |
| A18 | Souris anti-humaine kininogène (LMW) anticorps monoclonal | Kininogène | Assaypro | 20333-05011 |
| A19 | De lapin anti-humain MMP-21 anticorps monoclonal | MMP21 | Epitomic | 1955-1 |
| A20 | Souris anti-humaine-1 CEACAM antibod monoclonaly | CEACAM | R & D Systems | MAB1180 |
| A21 | Rat anti-humaine DPPIV/cd26 anticorps monoclonal | DPPIV | R & D Systems | MAB22441 |
| A22 | Souris anti-humaine PIVKA II anticorps monoclonal | PIVICA | Cristal chem | 8040 |
| A23 | Souris anti-antigène carcino-embryonnaire | CEA | US biologique | C1300 |
| A24 | Antigène de souris anti-CA125 cancer | CA125 | US biologique | C0050-01D |
| A25 | Souris anti-CA19-9 du cancer antigène | CA19-9 | US biologique | C0075-18 |
| A26 | Souris anti-Lewis x anticorps monoclonal | X Lewis | Calbiochem | 434631 |
| bio | Biotinylé BSA (contrôle positif) | Bio | Home-made | N / A |
Tableau 1. Liste des lectines et les anticorps utilisés dans ce protocole.
| Nom de / du réactif s équipements | Entreprise | Numéro de catalogue |
|---|---|---|
| Microarrayer sans contact | BioDot Inc | sciFLEXARRAYER |
| 384 microplaques | Pêcheur | 14-230-243 |
| FoodSaver | FoodSaver | V3835 |
| Ultrathin nitrocellulose Coate microarray glisse | Gentel | PATH |
| Diapositive impression (en option) | La Société Gel | WSP60-1 |
| Shaker | Pêcheur | 15-453-211 |
| Centrifuger | Eppendorf | 5804 000.013 |
| Glissez à laver la vaisselle coloration bassin / Slide avec rack amovible | Pêcheur | 08-812 |
| Incubation des lames diapositive boîte de chambre / microscope | Pêcheur | 03-448-5 |
| Brij 35, solution à 30% p / v dans l'eau | Acros Organics | AC32958-0025 |
| Tween-20 | Pêcheur | P337-100 |
| Periodate de sodium (NaIO 4) | Sigma | 311448 |
| L-acide glutamique γ-hydrazide | Sigma | G-7257 |
| Acétate de sodium anhydre (CH 3 COONa) | Sigma | S2889 |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Lampire Labs biologique | 7500804 |
| Tampon phosphate salin (PBS) (10X) | Denville scientifique | CP4390-48 |
| Dylight 549 neutravidine conjugué | Thermo | 22837 |
| Comprimés inhibiteurs de la protéase à cocktails | Roche | 4693159001 |
| ChromPure IgG humaine, fragment Fc | Jackson Immunoresearch | 009-000-008 |
| ChromPure IgG humaine, molécule entière | Jackson Immunoresearch | 009-000-003 |
| ChromPure IgG de souris, molécule entière | Jackson Immunoresearch | 015-000-003 |
| ChromPure IgG de souris, le fragment Fc | Jackson Immunoresearch | 015-000-008 |
| ChromPure IgG de lapin, molécule entière | Jackson Immunoresearch | 011-000-003 |
| ChromPure âne IgG, molécule ensemble | Jackson Immunoresearch | 017-000-003 |
| Microarray Scanner | Tecan | LS Reloaded |
Tableau 2. Liste des équipements et des réactifs utilisés dans le présent protocole.
Références
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