Article de méthode

Mesure Single Cell de la libération de dopamine avec Voltage-clamp simultanée et Amperometry

DOI :

10.3791/3798

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21 novembre 2012

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1Department of Neuroscience, University of Florida , 2Department of Psychiatry, University of Florida

Dans cet article

Résumé

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La technique de mesure ampérométrique la libération de dopamine à partir d'une seule cellule en détectant le courant oxydatif produit par oxydation spontanée dopamine. Pince simultanée de la tension et de la méthodologie ampérométrie révéler la relation mécanique entre l'ensemble «activité» du transporteur de la dopamine et le rôle régulateur de l'activité sur le transport inverse de la dopamine.

Résumé

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Après sa libération dans la fente synaptique, la dopamine exerce ses propriétés biologiques par l'intermédiaire de ses objectifs pré-et post-synaptique 1. Le signal de la dopamine se termine par la diffusion de 2-3, enzymes extracellulaires 4 et transporteurs membranaires 5. Le transporteur de la dopamine, située dans la fente péri-synaptique des neurones dopaminergiques efface les amines libérées par un flux entrant de dopamine (absorption). Le transporteur de la dopamine peut aussi fonctionner dans le sens inverse pour libérer des amines de l'intérieur vers l'extérieur dans un processus appelé transport vers l'extérieur ou l'efflux de dopamine 5. . Plus de 20 ans, Sulzer et al ont rapporté le transporteur de la dopamine peut fonctionner en deux modes d'activité: avant (absorption) et inverse (efflux) 5. Le neurotransmetteur libéré par efflux par le transporteur peut transporter une grande quantité de dopamine dans l'espace extracellulaire, et il a été montré à jouer un rôle majeur dans la régulation extracellulaire de dopamine homeostasis 6. Nous décrivons ici comment patch-clamp et l'enregistrement simultanés ampérométrie peut être utilisé pour mesurer la dopamine libérée par l'intermédiaire du mécanisme d'efflux avec une résolution temporelle millisecondes lorsque le potentiel de la membrane est contrôlée. Pour cela, l'ensemble de la cellule courante et à l'oxydation (ampérométrique) signaux sont mesurés simultanément en utilisant un amplificateur Axopatch 200B (Molecular Devices, avec un ensemble de Bessel passe-bas du filtre à 1.000 Hz pour l'ensemble des cellules d'enregistrement en cours). Pour l'enregistrement d'une électrode ampérométrique fibre de carbone est reliée à un second amplificateur (200B Axopatch) et est placé à côté de la membrane plasmique et maintenu à +700 mV. Les cellules entières et à l'oxydation (ampérométrique) courants peuvent être enregistrées et la relation courant-tension peut être généré à l'aide d'un protocole échelon de tension. Contrairement à l'étalonnage d'habitude ampérométrique, qui exige la conversion de la concentration, le courant est directement signalé sans tenir compte de la 7 fois le volume efficace. Ainsi, les données qui en résultentreprésentent une limite inférieure à efflux de dopamine parce que certains émetteur est perdu à la solution en vrac.

Protocole

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1. Matériel et fournitures

  1. Monter une cage de Faraday sur le dessus de la table anti-vibration (TMI) pour diminuer le bruit de fond.
  2. La pince simultanée correctif d'enregistrement ampérométrie système nécessite un microscope inversé avec d'excellentes optiques DIC et une lentille longue distance de travail. Branchez le microscope phare à une batterie de voiture. Cette source de lumière continue pour le système va encore réduire le bruit électrique.
  3. Micromanipulateurs hydrauliques (Siskiyou) diminution supplémentaire du bruit. Dans notre configuration, nous utilisons un manipulateur droitier pour l'enregistrement de cellules ....

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Résultats

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Patch-clamp combinée avec ampérométrie peut mesurer la tension en fonction de DAT DA induite par efflux. Figure 2A montre une configuration représentative expérimentale et l'enregistrement des DAT DA induite par efflux lorsque le milieu intracellulaire et le potentiel de membrane sont serrées par une pipette de patch de cellule entière. En utilisant cette technique, les cellules exprimant les protéines YFP-DAT sont serrées en tension avec une pipette de patch pendant toute cellule d'une électrode ampéro.......

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Discussion

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Simultanée voltage-clamp et ampérométrie présente les avantages suivants. Tous les types de cellules sont accessibles et peuvent être utilisés pour l'enregistrement. L'identification des cellules ou neurones où les enregistrements sont effectués est simple et direct. En particulier, si la cellule est marquée par fluorescence par addition d'un marqueur fluorescent pour la protéine d'intérêt à l'expérimentateur peut facilement sélectionner la cellule cible ou des neurones. La configuration expérimental.......

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Déclarations de divulgation

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Aucun conflit d'intérêt déclaré.

Remerciements

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Nous remercions le Dr Chirwa Sanika à l'examen critique de ce manuscrit. Ce travail a été soutenu par les Instituts nationaux de la santé (DA026947, DA021471 et NS071122).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Équipement
Anti-vibration table w / cage de Faraday Technique Manufacturing Corporation 63-500 série nous utilisons le modèle 63-543
Microscope inversé Nikon TE-2000 Nikon interrompu maintenant Eclipse Ti
Deux amplificateurs à faible bruit Axopatch 200B Molecular Devices 800-635-5577
1-203 CV headstage BU Molecular Devices 800-635-5578
HL-1-U porte-pipette Molecular Devices 800-635-5579
Digidata 1440A convertisseur A / N Molecular Devices 800-635-5580
Deux manipulateurs Siskyou, gaucheet droitier Siskiyou MX6600R MX6600L 877-313-6418
Laser pipette extracteur Sutter Instruments P-2000 888-883-0128
Faible bruit de fibres de carbone électrode ampérométrique ProCFE www.dagan.com
Faible bruit de quartz pipette Sutter Instruments QF100-70-7.5 888-883-0128
Batterie de voiture de 12 volts largement disponibles
Chargeur de batterie de voiture largement disponibles
Réactif
Chlorure de sodium (NaCl) Sigma S7653
HEPES Sigma H3375
Dextrose Sigma G7528
Le sulfate de magnésium (MgSO 4) Sigma M2643
Phosphate de potassium monobasique (KH 2 PO 4) Sigma P5655
Le chlorure de potassium (KCl) Sigma P9333
Dihydrate de chlorure de calcium (CaCl 2 • 2H 2 0) Sigma 223506
Hexahydrate de chlorure de magnésium (MgCl 2 • 6H 2 0) Sigma M2670
EGTA Sigma E0396

Références

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  1. Michael, A. C., Ikeda, M., Justice, J. B. Jr Mechanisms contributing to the recovery of striatal releasable dopamine following MFB stimulation. Brain Res. 421, 325-335 (1987).
  2. Gonon, F. Prolonged and extrasynaptic ....

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Mots-clés

Amp rom trie voltage clamptransporteur de la dopaminetransport inversepatch clamp en configuration cellule enti relectrode fibre de carbonecourant m di par DATenregistrement simultancontr le du potentiel de membranemesure du courant d oxydation

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