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1. Reprogrammation par rétrovirus exprimant les facteurs de reprogrammation
- Des fibroblastes humains sont cultivées dans un milieu des fibroblastes (10% de FBS dans DMEM avec Pen / Strep).
- Un jour avant l'infection, la plaque de 1x10 5 fibroblastes humains dans un puits d'une plaque à 6 puits.
- Aspirer à moyen et à éliminer les cellules mortes et ajoutez 2 ml de milieu de fibroblastes frais. Ajouter du sulfate de protamine à une concentration finale de 5 ng / ml.
- Soigneusement ajouter la quantité appropriée de chacun des virus GFP-exprimer correspondant à une multiplicité d'infection (MOI) 5 5.
- Un jour après l'infection, retirer le surnageant viral, laver trois fois avec 2 ml de PBS, puis ajoutez les 2 moyennes des fibroblastes ml.
- Trois jours après l'infection, vérifier la fluorescence de la GFP et de reconstituer le puits avec 2 moyennes des fibroblastes ml.
- Quatre jours après l'infection, la plaque de 1x10 cellules nourricières 4 / cm 2 de fibroblastes embryonnaires irradiés (MEF) dans le milieu des fibroblastes SUR UNE10-cm boîte de Pétri revêtues de 0,1% de gélatine. Incuber à 37 ° C pendant la nuit.
- Cinq jours après l'infection, se détacher des fibroblastes humains infectés avec 1 ml 0,05% typsin / EDTA pendant 5 minutes à 37 ° C, et centrifuger pendant 5 minutes à 200 g. Aspirer le milieu et remettre en suspension les cellules avec 10 ml de milieu de fibroblastes. Transférer les cellules dans un pré-enduit la plaque de 10 cm.
- Après 24 heures, remplacer le milieu de milieu de culture des CSEh (20% Knock-Out de remplacement du sérum, DMEM/F12, 0,1 ml non-acides aminés essentiels, 4 ng / ml de bFGF, Pen / Strep / glutamate, le bêta-merceptoethanol). Changer le support quotidien. ESC-like colonies commencent à apparaître 20 à 27 par jour après l'infection.
2. L'isolement et l'expansion des CSPi
- Sous un microscope à fluorescence, vérifier l'absence de fluorescence de la GFP dans une colonie qui montre une morphologie similaire à CSEh.
- En utilisant une pipette de 10 ul, choisissez individuels colonies IPSC et les placer dans un puits d'une gélatine et MEF-coaTed de 12 puits de plaque et complétée avec le milieu de CSEh. Changer le milieu tous les jours.
- Pour repiquage, laver la plaque avec 1 ml de DMEM/F12, puis ajoutez 0,5 ml de collagénase, et incuber pendant 10 minutes à 37 ° C.
- Laver les cellules deux fois avec DMEM/F12.
- Ajouter 2 ml de milieu CSEh frais. L'utilisation d'un lève-cellule, de briser les colonies en petits morceaux et détacher les cellules restantes de la plaque.
- Transférer les morceaux de remises en suspension des colonies dans un puits d'une gélatine et MEF-enduit des plaques 6 puits.
3. Analyse par immunofluorescence de marqueurs pluripotentes
- Laver les cellules trois fois avec du PBS et le fixer avec du paraformaldéhyde à 4% pendant 20 min à température ambiante.
- Lavez délicatement les cellules trois fois avec du PBS et perméabiliser avec 0,2% de Triton X-100 dans du PBS pendant 30 min.
- Bloquer non-spécifiques de liaison par incubation des cellules avec de la BSA 3% dans du PBS pendant deux heures.
- Incuber les cellules avec l'anticorps primaire nuit à 4 ° C.
- Laver les cellules trois fois avec du PBS et laisser incuber les cellules avec l'anticorps secondaire spécifique pendant une heure à température ambiante, le blindage de la lumière.
- Laver les cellules trois fois avec du PBS et ajouter DAPI lors du dernier rinçage suivie d'une incubation à température ambiante pendant 5 minutes.
- Détecter la coloration avec un microscope à fluorescence.
4. Quantitative en temps réel PCR pour les marqueurs pluripotentes
- Isoler l'ARN total à partir des CSPi humaines dérivées de fibroblastes humains en utilisant le kit RNeasy de Qiagen.
- Synthétiser l'ADNc de premier brin en utilisant la transcriptase inverse SuperScript II.
- Effectuer qPCR pour détecter les gènes de pluripotence en utilisant des amorces précédemment rapportés. 6
5. Les résultats représentatifs
- Changement morphologique lors de la reprogrammation
Nous fibroblastes humains infectés BJ1 et Detroit 551 avec un cocktail de rétrovirus transportant OCT4, SOX2, KLF4 et MYC,et étaient capables de détecter des changements morphologiques lors de la reprogrammation (Figure 1). Vingt-et-un jours après l'infection, nous reconnaissons de petites colonies iPSC par leur morphologie CSEh. En outre, nous reconnaissons CSPi par la fluorescence de la GFP. Les cellules souches pluripotentes, comme les CES et iPSCs, expriment la machinerie moléculaire de réprimer l'expression du gène proviral 7-9. Notre unique vecteur rétroviral exprime la GFP en collaboration avec la reprogrammation des gènes par LTR rétroviral. Ainsi, les cellules exprimant la GFP en continu sont considérés à exprimer des transgènes sans gene silencing proviral. Fidèlement reprogrammées colonies iPSC qui acquièrent le réseau pluripotence moléculaire montrent l'absence d'expression de GFP (Figure 2) 10.
- Caractérisation de la pluripotence des CSPi humaines
Nous avons analysé colonies issues de Detroit-551 fibroblastes par l'intermédiaire d'immunohistochimie avec Tra-1-81, Tra-1-60, AESS-4, SSEA-3, et des anticorps OCT4 NANOG ( (figure 3A). Nous avons également analysé l'expression génique par l'intermédiaire RT-PCR quantitative d'analyse. Nous avons observé que l'expression de OCT4, SOX2, KLF4, MYC et NANOG a été significativement augmenté par rapport à des cellules de fibroblastes parentaux, mais en rapport avec celle de CSEh H9 (figure 3B).
Figure 1. Les modifications morphologiques des rétrovirus-infectés fibroblastes humains. (AD) Progressive changement morphologique dans les colonies de Detroit-551 fibroblastes infectés avec des facteurs de reprogrammation. Jour 5 (A), Jour 10 (B), Jour 14 (C), jour 21 (D). Les cellules montrent la morphologie de CSEh comme après 21 jours.
Figure 2. Représentant GFP fluorescente expression dans les cellules subissant une reprogrammation. 4, et incubées dans un milieu CSEh pendant quatre semaines. Fibroblastes BJ (A, B) et Detroit 551 (C, D) montrent similaires morphologique. De jour 21, les colonies GFP négatifs commencent à se former, qui représentent les CSPi de bonne foi 10. (E, F) montrent transformé Detroit 551 cellules qui n'ont pas subi une reprogrammation appropriée. (A, C, E) des colonies sous vue contraste de phase. (B, D) correctement reprogrammé les cellules qui montrent le silence GFP. (F) expression de la GFP lumineux de la colonie transformée.
Figure 3. Caractérisation des humains cellules souches pluripotentes induites. (A) de l'homme des colonies de cellules iPS-551-K1 expriment des marqueurs communs aux cellules pluripotentes. Coloration DAPI indique le contenu de la cellule total par domaine. (B) quantitative en temps réel-PCR (RT-qPCR) pour l'expression de OCT4, SOX2, KLF4, MYC dans f parentaleibroblast, 551-iPS-K1 CSPi et H9 cellules souches embryonnaires humaines (CSEh). Les données ont été normalisées par rapport gène de ménage β-actine et tracées par rapport au niveau d'expression dans les cellules de fibroblastes parentaux 4.