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Article de méthode

Un crible génétique pour isoler Toxoplasma gondii Mutants Egress de la cellule hôte

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DOI :

10.3791/3807

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8 février 2012

 , 
1Department of Biology, Boston College

Dans cet article

Résumé

Transférer la génétique est une méthode puissante pour percer au niveau moléculaire de la façon dont Toxoplasma Egresses de sa cellule hôte. Les protocoles sont fournis à chimiquement mutagénéiser parasites, d'enrichir de mutants présentant des défauts dans l'évacuation induite, et de valider le phénotype des mutants clonés.

Résumé

Le répandue, intracellulaire obligatoire, parasite protozoaire Toxoplasma gondii qui cause la maladie opportuniste dans les patients immunodéprimés et provoque des malformations congénitales lors de l'infection congénitale. Le cycle de réplication lytique est caractérisée par trois étapes: 1. invasion active d'une cellule hôte nucléé; 2. réplication dans la cellule hôte; 3. évacuation connexion de la cellule hôte. Le mécanisme de sortie est de plus en plus apprécié comme un processus unique et très réglementé, qui est encore mal comprise au niveau moléculaire. Les voies de signalisation qui sous-tendent l'évacuation ont été caractérisées par l'utilisation d'agents pharmacologiques agissant sur ​​les différents aspects des voies 1-5. En tant que tel, plusieurs déclencheurs indépendants d'évacuation ont été identifiées qui convergent toutes sur la libération de Ca 2 + intracellulaire, un signal qui est également critique pour l'invasion des cellules d'accueil 6-8. Cette idée a informé une approche gène candidat qui a conduit à l'identificationfication de la plante comme la protéine kinase dépendante du calcium (CDPK) impliqués dans l'évacuation 9. En outre, quelques avancées récentes dans la compréhension de sortie ont été réalisés en utilisant (chimique) des approches génétiques 10-12. Pour combiner la richesse de l'information pharmacologique de l'accessibilité croissante génétique de Toxoplasma nous avons récemment créé un écran permettant l'enrichissement de mutants du parasite avec un défaut de sortie cellule hôte 13. Bien que la mutagenèse chimique utilisant le N-éthyl-N-nitroso-urée (ENU) ou le méthanesulfonate d'éthyle (EMS) a été utilisé pendant des décennies dans l'étude de la biologie Toxoplasma 11,14,15, n'est que récemment que la cartographie génétique des mutations qui sous-tendent les phénotypes devenu une routine 16 -18. En outre, en générant des mutants sensibles à la température, les processus essentiels peuvent être disséqués et les gènes sous-jacents directement identifié. Ces mutants se comporter comme de type sauvage en vertu de la température permissive (35 ° C), mais ne parviennent pas à proliferate à la température restrictive (40 ° C) en tant que résultat de la mutation en question. Ici, nous illustrer une nouvelle méthode de criblage phénotypique à isoler des mutants avec un phénotype sensible à la température de sortie 13. Le défi pour les écrans d'évacuation est de séparer est sorti de non-évacué parasites, qui est compliqué par la ré-invasion rapide et collant générale des parasites aux cellules hôtes. Un écran de sortie a été précédemment établi sur la base d'une série d'étapes lourdes biotinylation de séparer intracellulaire de parasites extracellulaires 11. Cette méthode n'a pas non plus générer des mutants conditionnels résultant de phénotypes faibles. La méthode décrite ici surmonte le fort attachement de egressing parasites en incluant un concurrent glycane, le sulfate de dextrane (DS), qui empêche les parasites de coller à la cellule 19 hôte. En outre, les parasites extracellulaires sont spécifiquement tué par la pyrrolidine dithiocarbamate (PDTC), ce qui laisse des parasites intracellulairessains et saufs 20. Par conséquent, avec un nouvel écran phénotypique spécifiquement isoler des mutants de parasites avec les défauts de sortie induite, la puissance de la génétique peuvent désormais être pleinement déployé à élucider les mécanismes moléculaires qui sous-tendent l'évacuation cellule hôte.

Protocole

Vue d'ensemble

Les protocoles sont fournis à d'abord définir le dosage de l'agent mutagène menant à un meurtre de 70% des parasites (protocole 1). La procédure suivante est prévue pour enrichir les mutants induits évacuation d'un bassin mutagénisé parasite (protocole n ° 2, figure 2). Cette opération est suivie par un protocole pour tester l'incidence de mutants d'évacuation dans la piscine enrichi, ou pour valider le phénotype de sortie dans des mutants individuels (protocole 3). Enfin, un protocole est prévu pour générer des clones de parasites unique à partir de populations enrichies en limitant la dilution (protocole 4).

1. Le titrage de mutagène

Utilisez une prudence particulière, tels que des gants doubles, lorsque l'on travaille avec des composés hautement mutagènes et liquides. Collecter les déchets liquides séparément pour une élimination appropriée.

  1. Inoculer T25 flacons de culture tissulaire avec l'homme confluentes de fibroblastes de prépuce (HFF), les cellules avec 1 ml de tachyzoïtes fraîchement lysées et la croissance 18-25 heures à 37 °; C sous 5% de CO 2 dans Ed1 moyennes (D-MEM supplémenté avec 1% inactivé par la chaleur du sérum de veau foetal, 0,2 mM de L-glutamine, 50 U / ml de pénicilline, 50 pg / ml de streptomycine, et 0,25 pg / ml d'amphotéricine B ). Voir Roos et al. pour la croissance et les médias de cellules HFF et les parasites 21.
  2. Remplacer milieu avec 10 ml de 0,1% à moyen Sérum fœtal bovin (dilué 1:10 dans Ed1 D-MEM) et laisser dans humidifié 37 ° C sous incubateur 5% de CO 2 (appelé "37 ° C incubateur» à partir d'ici) pendant 10 min .
  3. Ajouter 0, 12,5, 25, 50, ou 100 ENU ul (1 Stock M dans le DMSO) ou EMS (1 Stock M dans le DMSO) par flacon (dilutions mutagènes de travail sera de 1,25, 2,5, 5, et 10 mM, respectivement). Ajouter DMSO à 100 pi pour chaque flacon. Incuber pendant 4 heures dans un incubateur à 37 ° C.
  4. Laver trois fois pendant 10 secondes à température ambiante par rinçage de la monocouche avec 10 ml de PBS froid (pré-refroidi à 4 ° C).
  5. Ajouter 5 ml de PBS, gratter la monocouche lâche avec une spatule en caoutchouc (cellulaire scraper), passer les cellules grattées à travers une aiguille de 26,5 g pour éliminer physiquement le parasite à partir des fibroblastes (couper l'arbre à l'extérieur de l'aiguille avec des ciseaux lourds à ne pas exposer l'aiguille), et le filtre de 3,0 um filtre en polycarbonate. Passages d'aiguilles multiples augmentera l'efficacité de la libération des parasites de la cellule hôte.
  6. Comptez la concentration des parasites à l'aide d'un hémocytomètre. Laissez les parasites se contenter de 5 min dans le hemocytomer avant le comptage.
  7. Diluer les parasites à 10.000 parasites par 3 ml dans Ed1 (pour 10 ml 33.333 parasites sont nécessaires).
  8. Inoculer un puits dans une plaque à 6 puits avec 3 ml des parasites dilué (contenant 10.000 parasites). Série diluer les parasites de 10 fois plus de 3 puits dans un affluent plaque à 6 puits avec des cellules HFF contenant 2,7 ml Ed1 en transférant 300 pi sur le premier puits. Laisser les plaques vierges dans l'incubateur à 37 ° C pendant 7 jours.
  9. Aspirer à moyen, fixer 15 min avec 3 ml / puits d'éthanol à 100%, de la teintureavec 3 ml / puits solution de cristal violet (12,5 g de violet cristallisé dans 125 ml d'éthanol mélangé avec 500 ml d'oxalate d'ammonium à 1%) pendant 15 min, rincer avec de 3 ml / puits de PBS (1 minute) et l'air sec. Tout à la température ambiante.
  10. Comptez plaques et sélectionnez la concentration du mutagène nécessaire pour atteindre la survie de 30% des parasites exposés (70% tuant dosage: voir figure 1). Une dose de meurtre 70% a été utilisé historiquement 14 et induit moins de 100 mutations ponctuelles par génome (Farrell, Marth, Gubbels et al., Manuscrit soumis).

2. Enrichissement de mutants d'évacuation (Figure 2)

  1. Effectuer mutagenèse comme décrit ci-dessus en utilisant une dose mutagène induire meurtre de 70%. Grow up de la population mutagénisé pour un passage dans un nouveau flacon de cellules hôtes.
  2. Infecter un T25, HFF flacon confluent de culture tissulaire avec 120.000 parasites fraîchement lysées à partir d'une population mutagénisé dans 10 ml Ed1. Incuber pendant 2 heures dans un incubateur à 35 ° C sous 5% de CO2 et humidifié (à partir de maintenant appelé «incubateur à 35 ° C").
  3. Aspirer à moyen et rincer 10 secondes avec 10 ml de PBS froid, puis ajouter 10 ml Ed1 milieu supplémenté avec 25 mg / ml de sulfate de dextrane (DS) 13. Incuber pendant 26 heures dans un incubateur à 40 ° C sous 5% de CO 2 et humidifié (à partir de maintenant appelé «incubateur à 40 ° C").
  4. Préparer la solution de travail d'exhausteurs de sortie. Diluer l'inducteur de sortie de choix à la concentration de travail dans un tube Falcon de 15 ml contenant 10 ml HBSSc complété avec 25 mg / ml DS. Préchauffer les dilutions pendant 30 min dans un bain-marie à 37 ° C. Voir le tableau 1 pour les concentrations de travail.
  5. Aspirer milieu à partir des flacons parasités et ajouter préchauffé solution inducteur de sortie. Incuber dans l'incubateur à 37 ° C pendant les temps indiqués dans le tableau 1.
  6. Aspirer à moyen et rincer 10 secondes avec 10 ml de PBS froid, puis ajouter 10 ml Ed1 additionné de 25 mg / ml et 50 uM DS pyrrolidine dithiocarbamate (PDTC: add 5 pi de 100 mM dans du PBS PDTC Stock) 13. Incuber 5 heures dans un incubateur à 35 ° C.
  7. Aspirer à moyen et rincer 10 secondes une fois avec 10 ml de PBS (température ambiante), puis ajouter 10 ml Ed1 moyennes. Mettez flacons de retour dans l'incubateur à 35 ° C jusqu'à ce que les parasites de détruire la monocouche: flacons agités par jour. Cette reprise prend environ 7 jours.

3. La validation des phénotypes mutants par des essais d'évacuation

Après avoir effectué l'écran d'enrichissement et de plus en plus la population enrichie pour un passage dans les cellules HFF, les phénotypes doivent être confirmés par un dosage 11,13 évacuation. Ce test devrait également être utilisée pour valider des clones individuels après le protocole 4.

  1. Inoculer 20.000 parasites par puits dans une plaque de 24 puits contenant des cellules HFF cultivées sur des lamelles confluentes (1 ml Ed1 milieu par puits). Incuber 8 heures dans un incubateur à 35 ° C, puis transférer dans un incubateur à 40 ° C pendant 24 heures.
  2. Laver avec 1 ml / puits de PBS (10 secondes à la température ambiante). Ajouter 1 ml d'évacuation des inducteurs (inclure une DMSO ne contrôle négatif), les pré-chauffées et dilué dans HBSSc et les incuber pendant les périodes décrites dans le tableau 1.
  3. Aspirer à moyen et à fixer avec 1 ml / puits du méthanol à 100% pendant 15 min à température ambiante.
  4. Si les parasites mères exprimant une protéine autofluorescente ont été utilisés pour la mutagenèse, passez à l'étape # 3.5 13. Si les parasites protéines fluorescentes non-exprimant ont été utilisés comme ligne de parent, de la teinture des lamelles fixes avec Diff-Quick tache pendant 1 min à 11 température ambiante.
  5. Laver 5 min avec 1 ml / puits de PBS dans la plaque de 24 puits à température ambiante.
  6. Pour les parasites protéines fluorescentes exprimant: rincer rapidement la lamelle dans le trou DDH 2 O (trempage) et monter sur des lames sous gelmount pour protéger le signal de fluorescence. Pour Diff-Quick parasites colorés, se laver de 10 secondes dans l'éthanol à 100% et laissez sécher à l'air avant de monter sur la diapositive.
  7. Utilisation d'un microscope à fluorescence () avec un40-60x objectif de compter le pourcentage de vacuoles évacué par rapport aux vacuoles qui sont restés intracellulaire (voir Figure 4).

4. Cloner mutants d'évacuation en limitant la dilution

Après validation du phénotype de la population de sortie en utilisant le protocole enrichi mutante 3, la population polyclonaux doit être cloné pour obtenir des clones uniques parasites.

  1. Dénombrement de la population du parasite dans un hémocytomètre et diluer à une concentration de 500 parasites par ml dans Ed1 moyennes.
  2. Dans une plaque de 384 puits contenant une monocouche confluente de cellules HFF, remplacer le milieu avec 40 ul / puits de Ed1 milieu à l'aide d'une pipette multi-canaux. Comme le montre la Figure 5, quatre populations polyclonales peuvent être clonées par plaque comme suit: pipette 40 ul / puits de dilution mutant 1 dans les puits C3-C12, un mutant 2 dans les puits C13-C22, un mutant 3 dans des puits H3-H12, et mutant 4 dans les puits H13-H22 (volume final dans les puits est désormais de 80 pi). L'utilisation d'un multi-canal pipette, pipette le solution de haut en bas 5 fois, puis de transférer 40 ul à la ligne en dessous de la ligne de départ (à partir de la ligne C à D ou de la ligne H à I). Continuer ces dilutions de 2 fois en série dans le rang G (mutants 1 et 2) ou de la ligne N (mutants 3 et 4). Jeter le supplément de 40 ul de la dernière rangée. Incuber dans un incubateur à 35 ° C pendant 7-10 jours sans perturber la plaque.
  3. Vérifier les puits sur un microscope inversé avec un objectif 10-20x pour la présence de plaques uniques, visible en tant que des trous 'dans la monocouche.
  4. Pick 4 puits par mutant avec une seule plaque et transférer les parasites dans un flacon de culture de tissu confluente avec des cellules HFF et rempli de Ed1 moyennes. Grow les parasites dans un incubateur à 35 ° C; secouer les flacons par jour pour disperser les parasites extracellulaires. Cela prend habituellement de 7 jours.

5. Les résultats représentatifs

Le ENU mutagènes et EMS ne sont pas stables lorsqu'ils sont conservés sur de longues périodes de temps. Par conséquent, tester le pouvoir mutagène dedes stocks est cruciale pour obtenir des résultats reproductibles. Les résultats de titrage typiques et tuant des courbes à la fois pour ENU et les EMS sont présentés dans la figure 1. Cependant, il est recommandé d'effectuer des essais de plaque pour chaque expérience de mutagenèse afin de s'assurer que la dose appropriée a été utilisée. Pour maintenir la diversité dans la population parasite mutagénisé, il est important de procéder à l'écran de sortie mutant le plus rapidement possible. En règle générale, un passage des parasites dans un nouveau flacon est effectué pour laisser les parasites survivants de récupérer avant d'aller de l'avant avec l'écran. Il faut garder à l'esprit que, ce faisant cela se traduira dans la division des mutants. Par conséquent, il ne peut pas être exclu que plusieurs mutants isolés clonales après avoir terminé toute la procédure contiennent exactement le même génotype. Pour éviter d'isoler les mutants mêmes plusieurs fois, il est recommandé d'isoler seulement un mutant de sortie unique par mutagenèse, à moins que leurs phénotypes (par exemple les différentes sensibilités d'évacuation inducteurs) sonttrès différente de l'autre. D'autre part, ne sont pas tous les résultats du dépistage dans l'isolement de mutants avec le phénotype souhaité. En particulier, le Ca 2 +-ionophore A23187 phénotype de résistance est rare et exige de multiples expériences de mutagenèse et les écrans d'isoler un mutant de sortie unique. Par conséquent, il est recommandé d'effectuer une mutagenèse 5-10 et expériences d'écran en parallèle.

La puissance d'enrichissement de l'écran a été testé par le mélange d'un mutant de sortie connue avec des parasites de type sauvage à des taux différents. Ces mélanges ont été soumis à l'écran et l'incidence du phénotype mutant dans la population enrichi a été évaluée. En utilisant des parasites de type sauvage exprimant cytoplasmique DP et une ligne mutante exprimant YFP cytoplasmique des incidences pourraient être rapidement mis en place par cytométrie en flux (Figure 3) 13. Les résultats montrent que les phénotypes mutants peuvent être régulièrement enrichi à 80% de pureté en commençant par 1 parasite mutant de sortie pour 10.000 sauvage de type parasites 13. Toutefois, lorsque la sortie mutant: de type sauvage rapport de démarrage parasite est 1:100,000 parasites, la population isolée est seulement 1-2% des mutants de sortie (1:100). Par conséquent, le pouvoir d'enrichissement de l'écran est de 1000 fois. Depuis l'écran commence par l'inoculation de 120.000 parasites, dont 70% sont généralement viable, nous avons généralement effectuer deux tours de l'enrichissement. Les parasites isolés ont grandi entre les deux tours d'enrichissement. Cette procédure aboutit à une population de 100% mutant, même si à partir de 1:1,000,000 évacuation mutantes: les parasites de type sauvage.

Le dosage de sortie pour valider et caractériser les phénotypes nécessite une multiplicité d'infection cellule hôte qui permet la différenciation de vacuoles individuels. Cela est particulièrement important lors de l'analyse des conditions avec des pourcentages élevés d'évacuation que les parasites individuels sont dispersés autour. Comme le montre la figure 4, si les populations ne sont pas sortis de l'avion bien séparés, il est facile de sous-estimer le pourcentaged'évacuation en comptant deux vacuoles évacué comme un vacuole. Depuis l'évacuation et l'invasion sont des processus connexes, ainsi que certains phénotypes sensibles à la température présentent un phénotype légère à la plus basse température, tous les mutants auront l'efficacité d'invasion similaires. De tels mutants doivent donc être inoculée à plusieurs plis des dosages plus élevés pour obtenir une densité suffisamment élevée pour vacuole une évaluation précise de leur phénotype de sortie. En outre, certains inducteurs d'évacuation ne sont pas stimuler efficacement la sortie de vacuoles contenant quatre parasites ou moins. En tant que tel, il est important que les vacuoles contiennent huit parasites ou plus lors du démarrage du test de sortie. Dans notre laboratoire, nous mutants écran isolé avec un amplificateur de sortie particulier contre les exhausteurs d'évacuation d'autres. En dressant le profil de leur réactivité croisée des mutants peuvent être regroupés dans des classes différentes. Enfin, tous les mutants d'évacuation sera sensible à la température. Chez les mutants isolés particuliers avec des inducteurs d'évacuation de déclenchement des mesures avant la sortie de intracellular de Ca 2 + sont susceptibles de ne pas la température phénotypes sensibles. Cela est dû à des voies parallèles qui peuvent conduire à sortir de l'avion avant que le signal converge sur la libération de Ca 2 + intracellulaire.

figure-protocol-1
Figure 1. Titration chimique mutagène dosage. Dosages Plaque A. effectué dans une plaque à 6 puits à l'aide de diverses concentrations EMS et les numéros de divers parasites par puits comme indiqué. Les taches blanches sont des plaques de parasites formés dans la monocouche HFF. B, C. Les courbes de survie des parasites lors de l'exposition à des doses différentes de SME (B) et ENU (C). La survie a été évaluée par des tests de plaque. Une dose induisant meurtre de 70% est choisi pour des expériences de mutagenèse. Moyennes de trois expériences indépendantes + / - écart-type sont indiqués.

figure-protocol-2
Figure 2. Représentation schématique de l'écran d'enrichissement mutant de sortie. La température est indiquée sur l'axe des y, alors que la progression du temps est représenté par l'axe des x. Les parasites verts reflètent évacuation parasites mutants, des parasites rouges reflètent les parasites de type sauvage. Le calendrier des changements dans les conditions et la stimulation par un inducteur de sortie sont indiqués en haut et sont marqués par des flèches sur la ligne bleue qui reflète le profil de température. Adoptée à partir Eidell et al. 13.

figure-protocol-3
Figure 3. L'enrichissement typique d'évacuation phénotypes mutants. Résultats d'enrichissement d'un mutant de sortie mélangé à des parasites de type sauvage à des taux différents (axe X). Le pourcentage de phénotypes mutants d'évacuation de la population grandi après l'écran est représentée sur l'axe des y et a été évaluée par cytométrie de flux (évacuation des parasites mutants exprimé YFP cytoplasmique, les parasites de type sauvage a exprimé cytoplasmic DP). Les résultats de trois expériences indépendantes sont représentées par des points de données en rouge, bleu et vert. Adoptée à partir Eidell et al. 13.

figure-protocol-4
Figure 4. Les résultats typiques d'un essai de sortie. A Flèches marquer quatre différentes vacuoles intactes contenant des parasites 4-8. B. Les flèches marquent quatre groupes de parasites épars reflétant quatre indépendants vacuoles évacué. L'évacuation a été induite par A23187 (B) ou le DMSO comme un contrôle négatif (A). Parasites exprimer cytoplasmique YFP 22.

figure-protocol-5
Figure 5. Dilution en série pour les lignes parasites clonales. Quatre populations polyclonales (rouge, bleu, jaune, vert) sont dilués en série dans un affluent plaque de 384 puits unique avec des cellules HFF. Rangée C et je reçois 10 parasites par puits etsont 2 fois plus dilué (40 pl + 40 pl) jusqu'à ce que les lignes H et N, respectivement. La nuance de gris indique la diminution du nombre de parasites par puits. En règle générale, les clones isolés et se trouvent dans les lignes DF et JL.

Composé Stock La concentration de travail ul besoin de T25 (10 ml) Le temps d'incubation (min)
TNT M 1 dans du DMSO 5 mM 50 15
l'éthanol 190 Preuve 5% 500 30
A23187 2 mM dans du DMSO 1 uM 5 5
* nigéricine 2 mM dans du DMSO 10 uM 50 30

* Nigéricine ne peut pas être utilisé dans la enrichirment l'écran que les parasites ne survivent pas à la stimulation nigéricine; utiliser uniquement nigéricine à la validation des mutants de sortie.

Tableau 1 inducteurs Egress. Utilisés dans des procédures. Diluer dans 10 ml contenant HBBSc 25 mg / ml pour DS l'écran, ou aucun DS pour la validation mutant (test de sortie). Tous les composés de Sigma-Aldrich.

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Discussion

Le protocole décrit fournit une méthode efficace pour isoler des mutants de Toxoplasma avec un défaut de sortie. Nous avons réussi à isoler des mutants ainsi que différentes étapes de la voie de sortie, dont certains ont un phénotype invasion double 13. Les effets potentiels sur l'invasion peut être déterminé en utilisant la soi-disant test rouge-vert, ce qui différencie envahi de non-envahis par des parasites coloration des anticorps différentiel 23,24. Pour les tests d'inva...

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Déclarations de divulgation

Nous n'avons rien à communiquer.

Remerciements

Ce travail a été financé par l'American Heart Association scientifique de développement 0635480N Grant et National Institutes of Health des subventions de recherche AI081220. BIC est soutenu par une Templiers Eye Foundation subvention de recherche.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Nom du réactif Entreprise Numéro de catalogue Commentaires
ENU Sigma-Aldrich N3385 1 Stock M dans le DMSO, conserver à -20 ° C
EMS Sigma-Aldrich M0880 1 Stock M dans le DMSO, conserver à -20 ° C
Sulfate de Dextran Sigma-Aldrich D4911
PDTC Sigma-Aldrich P8765 100 Stock mM dans du PBS
Diff Quick EMD Chemicals 65044-93
Porte-filtre Cole-Parmer 540100
3 um filtre en polycarbonate WhatmanSchleicher & Schuell 110612
Hémocytomètre Hausser scientifique 1475
CO 2 incubateurs Divers fabricants Humidifié, 5% de CO 2, à 35, 37 et 40 ° C
Microscope à fluorescence Divers fabricants Idéalement inversé, à grand champ avec l'objectif de l'huile 63x ou 100x

HBSSc (selon Black et al 11.):

  • 98,0 ml Hanks Balanced Salt Solution (numéro de catalogue Hyclone SH30588)
  • 100 MgCl ul 1M 2 (100 mM fin)
  • 100 pi 1M CaCl 2 (100 mM fin)
  • 2,0 ml 1M Hepes pH 7,3 (20 mM fin)
  • 84 mg de NaHCO 3 (10 mM fin)

Références

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