Essai efflux de cholestérol

Résumé

Le dosage du cholestérol est conçu pour quantifier le taux de cholestérol efflux partir de cellules cultivées et la capacité de plasma accepteurs d'accepter le cholestérol libéré par les cellules. Le test se compose de marquage des cellules avec le cholestérol, l'équilibration du cholestérol entre les pools intracellulaires et la libération de cholestérol à un accepteur extracellulaire.

Résumé

La teneur en cholestérol des cellules doit être maintenue dans les limites très étroites, trop ou trop peu de cholestérol dans quelques résultats de cellules dans la perturbation des membranes cellulaires, l'apoptose et nécrose ^1. Les cellules peuvent cholestérol source à partir de la synthèse intracellulaire et de lipoprotéines plasmatiques, les deux sources sont suffisantes pour satisfaire pleinement les exigences des cellules pour le cholestérol. Les processus de synthèse du cholestérol et l'absorption sont strictement réglementées et les carences de cholestérol sont de ² rares. Le taux de cholestérol excessif est de ³ problème le plus courant. À l'exception des hépatocytes et des cellules corticosurrénales degré, les cellules sont incapables de dégrader le cholestérol. Les cellules ont deux options pour réduire leur teneur en cholestérol: pour convertir le cholestérol en esters de cholestérol, une option avec une capacité limitée que la surcharge des cellules avec des esters de cholestérol est également toxique, et l'efflux de cholestérol, une option avec une capacité potentiellement illimitée. Efflux de cholestérol est un specprocessus de l'IFIC qui est réglementée par un certain nombre de transporteurs intracellulaires, comme liaison de l'ATP des protéines transporteur ABC A1 (ABCA1) et G1 (ABCG1) et de type B1 scavenger receptor. L'accepteur naturel de cholestérol dans le plasma est lipoprotéines de haute densité (HDL) et de l'apolipoprotéine AI.

Le test d'efflux de cholestérol est conçu pour quantifier le taux de l'efflux de cholestérol à partir de cellules cultivées. Il mesure la capacité des cellules à maintenir efflux de cholestérol et / ou la capacité de plasma accepteurs d'accepter le cholestérol libéré par les cellules. Le dosage comprend les étapes suivantes. Etape 1: étiquetage cholestérol cellulaire en ajoutant cholestérol marqué à milieu contenant du sérum et incubation avec des cellules de 24-48 h. Cette étape peut être combiné avec le chargement de cellules avec le cholestérol. Étape 2: l'incubation des cellules dans un milieu sans sérum pour équilibrer le cholestérol marqué parmi tous les bassins cholestérol intracellulaire. Cette étape peut être combiné avec l'activation de cellules chtransporteurs olesterol. Étape 3: l'incubation des cellules avec l'accepteur extracellulaire et la quantification du mouvement du cholestérol marqué à partir de cellules à l'accepteur. Si précurseurs du cholestérol ont été utilisés pour étiqueter le taux de cholestérol nouvellement synthétisé, une quatrième étape, la purification du cholestérol, peuvent être nécessaires.

Le test fournit les informations suivantes: (i) la façon dont un traitement particulier (une mutation, un knock-down, une surexpression ou un traitement) affecte la capacité de la cellule au cholestérol efflux et (ii) la façon dont la capacité d'accepteurs de plasma à accepter le taux de cholestérol est affecté par une maladie ou d'un traitement. Cette méthode est souvent utilisée dans le contexte de la recherche cardiovasculaire, des troubles métaboliques et neurodégénératives, infectieuses et maladies de la reproduction.

Protocole

1. Préparation de la ^[3 H]-cholestérol

1. Dans la hotte, distribuer la quantité requise de cholestérol ^[3 H] dans un tube de 1,5 ml de micro (0,5 pCi (19 kBq) par puits est nécessaire pour un essai typique).
2. Si ^[3 H]-cholestérol est en suspension dans le toluène, le sécher complètement avec du gaz N2 et remettre en suspension avec de l'éthanol à 100% pour une concentration finale de 1 pCi (37 kBq / ul. Vortex et bien mélanger.

2. Étalement des cellules et à l'étiquetage du cholestérol cellulaire

Ce protocole a été testé en utilisant les types de cellules suivants: ^4,5 monocytes humains THP-1, les monocytes-macrophages humains ^6,7,8, RAW 264.7 de macrophages murins ^5,9,10,11, les cellules HeLa ^12, veine ombilicale humaine endothéliale cellules (HUVEC), des cellules BHK-21 ^9, les fibroblastes humains et de souris, les cellules HepG2 ^13,14 hépatocarcinome humain ¹⁵ et, dans une forme modifiée, à partir de plaquettes ^16.

1. Remettre en suspension les cellules et les compter. Cellules de la plaque dans des plaques 12 puits à la densité finale de 0.2x10 ⁶ cellules par puits dans 0,9 ml de milieu complet. Cellules continuera de croître et atteindra 0.8x10 ⁶ cellules par puits au moment de l'expérience efflux. Pour les cellules qui ne se divisent pas, comme différenciées cellules THP-1, la densité de semis doit être 0.8x10 ⁶ cellules par puits. Si vous utilisez 6 - ou plaques à 24 puits, double ou la moitié du nombre de cellules par puits, respectivement. Le nombre de puits devrait être suffisant pour les déterminations de quadruples pour chaque condition expérimentale.
2. Si la différenciation des cellules THP-1 est nécessaire, ajouter PMA (concentration finale 0,1 pg / ml) pour les médias pendant 48-72 h.
3. Ajouter une petite aliquote des médias dans le microtube contenant la ^[3 H] cholestérol.
4. Laver les côtés du tube avec les médias avant d'ajouter ^[3 H] cholestérol dans une partie aliquote de séparée des médias complets (100 pl / puits).
5. Ajouter des médias contenant ^[3 H] cholestérol dans les puits avec des cellules (volume final par puits est de 1 ml). Si aucun traitement de cellules est nécessaire avant le marquage, les cellules peuvent être étalées dans la ^[3 H] cholestérol milieu contenant.
6. Incuber les cellules pendant 48 heures dans incubateur de culture cellulaire (37 ° C, 5% de CO _2).

3. Incubation d'équilibration

1. Après 48 heures d'incubation, vérifier les cellules sous le microscope. Assurez-vous qu'ils sont en bonne santé et sont à environ 80% de confluence.
2. Retirez le support contenant ^[3 H] cholestérol. Laver les cellules délicatement avec du PBS. Répétez 3 fois de lavage.
3. Préparer un milieu sans sérum. Si nécessaire, activer les cellules en ajoutant un agoniste LXR (comme A-901 317 à 1-4 mmol / L) ou d'AMPc (0,3 mmol / L; pour les cellules d'origine de la souris uniquement) pour le sérum de libre-médias.
4. Ajouter 500 ul milieux exempts de sérum dans chaque puits.
5. Incuber pendant 18 heures dans l'incubateur de culture cellulaire (37 ° C, 5% de CO _2).

4. Incubation efflux de cholestérol

1. Après 18 heures d'incubation dans un milieu sans sérum, vérifier les cellules sous le microscope. Assurez-vous qu'ils sont en bonne santé et anastomosé (minimum de 80% de confluence).
2. Préparer une solution de cholestérol accepteurs d'efflux dans un milieu sans sérum. Exemples d'accepteurs comprennent:
   L'apolipoprotéine AI (apoA-I) (concentration finale de 10 pg / ml)
   Lipoprotéines de haute densité (HDL) (concentration finale de 20 pg / ml)
   Cyclodextrine (concentration finale 200 pg / ml)
   Plasma (concentration finale 1-2%)
3. Laver les cellules délicatement avec du PBS.
4. Ajouter 250 pi de milieu sans sérum avec des accepteurs à chaque puits.
5. Laisser un ensemble de puits pour déterminer fond efflux (efflux de milieux exempts de sérum avec NO accepteur)
6. Incuber les cellules pendant 2 heures dans incubateur de culture cellulaire (37 ° C, 5% de CO _2). Durée de l'incubation efflux peut varier de 30 min à 8 h si nécessaire.

5. Traitement Samples

1. Après 2 heures d'incubation vérifier cellules sous le microscope.
2. Recueillir des médias dans 1,5 ml microtubes. Centrifuger à 14000 rpm pour 1-10 min à température ambiante pour éliminer les débris cellulaires.
3. Transfert de 100 médias ul en 7 ml flacon à scintillation. Ajouter 5 ml d'Insta-Gel Plus (PerkinElmer) et le mélange de vortex. Conserver les échantillons restants à 4 ° C.
4. Placez les plaques dans le congélateur pendant 30 minutes. Ajouter 500 ul dH ₂ O dans chaque puits. Vérifiez les cellules sous le microscope pour s'assurer que toutes les cellules ont levé du fond de puits. Si encore adhérent, soit laisser les assiettes avec dH ₂ O à 4 ° C durant la nuit ou gratter les puits.
5. Une fois que toutes les cellules ont décollé, pipeter et pour briser les mottes de cellules. Transférer 100 ul en 7 flacons de scintillation ml. Ajouter 5 ml d'Insta-Gel Plus (PerkinElmer) et le mélange de vortex. Stocker les plaques restantes à 4 ° C.
6. Placez des flacons à scintillation sur un compteur à scintillation. Configurer compteur pour compter de ^[3 H] dansunités dpm.

6. L'analyse des résultats

1. Le taux de l'efflux de cholestérol est habituellement exprimé en proportion du cholestérol déplacé à partir de cellules à l'accepteur. La formule suivante est utilisée:

2. L'efflux spécifique est calculé comme une différence entre l'efflux de la présence ou l'absence de l'accepteur (vide).

7. Chronologie

8. Les résultats représentatifs

Un exemple de résultat d'une expérience d'efflux de cholestérol est indiqué dans la Fig. 1. Dans cette expérience, THP-1 monocytes humains ont été différenciées en macrophages et l'efflux de cholestérol à des accepteurs différents étaittesté. Efflux de cholestérol à moyen sans accepteurs ("blank") était de 0,79% et cette valeur a été considérée comme un efflux non spécifique et a été soustraite des autres valeurs. Efflux de cholestérol pour la santé humaine apoA-I (concentration finale de 30 pg / ml) était de 4,75%. Un échantillon de plasma de référence a été inclus dans cette expérience pour surveiller la variabilité inter-expérimentale. Un échantillon de référence peut être utilisé pour la normalisation des données à travers un grand nombre d'expériences, mais nous avons trouvé qu'il était prudent de répéter le dosage si la variabilité est élevée. Un plasma du patient (concentration finale de 2%) a été testé avant et après que le patient a été traité avec des médicaments. Il a été conclu que, dans ce médicament aux patients ont eu un impact négatif sur la capacité du plasma à soutenir l'efflux de cholestérol.

Un autre exemple d'un résultat de l'expérience efflux est montré dans la figure. 2. Dans cette expérience, les macrophages RAW 264.7 ont été activés ou non activés par une nuit d'incubation avec un agoniste de LXR TO-901 317 (concentration finale1 umol / L) et l'efflux de cholestérol au même échantillon de plasma humain (2%) a été testé. Il a été conclu que l'activation de l'expression cellulaire des transporteurs ABC avec un agoniste de LXR augmente la capacité des cellules à libérer le cholestérol à l'accepteur extracellulaire.

Figure 1. Efflux de cholestérol à partir de cellules THP-1 à différents accepteurs. Pourcentage de l'efflux de cholestérol (c.-à-la proportion de cholestérol marqué déplacé à partir de cellules à l'accepteur spécifié) est affiché après la soustraction des valeurs vides. Moyenne ± écart-type de déterminations quadruples, * p <0,05.

Figure 2. Efflux de cholestérol à partir de RAW 264.7 activée ou non activée avec un agoniste LXR pour le plasma humain. Pourcentage de l'efflux de cholestérol (c.-à-la proportion de cholestérol marqué déplacé à partir de cellules de laaccepteur spécifié) est affiché après la soustraction des valeurs vides. Moyenne ± écart-type de déterminations quadruples, * p <0,001.

Discussion

Le procédé décrit à mesurer efflux de cholestérol est conçu pour mesurer le mouvement du cholestérol des cellules à un accepteur de cholestérol extracellulaire. Il ya plusieurs considérations clés pour la compréhension de cette méthode.

L'étiquetage et l'équilibration

Dans la méthodologie décrite cholestérol marqué est ajouté au sérum contenant le sérum. Bien que n'ayant jamais étudié en détail, il est supposé que le taux de cholestérol est incorporé dan...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Réactifs Files cellules	HeLa	THP-1	RAW	HUVEC	BHK-21	HFF
Médias complètes	RPMI - 10% de FCS - 1% de L-glutamine - Streptocoque Pen 0,2%			M199 - 5% de FCS - 1% de L-glutamine - Streptocoque Pen 1% - HEPES 2% (1M) - 7% de supplément de croissance endothélial (ECGS)	DMEM - 10% de FCS - 1% de L-glutamine - Streptocoque Pen 0,2%
Milieux exempts de sérum	RPMI - 1% de L-glutamine - Streptocoque Pen 0,2%			M199 - 1% de L-glutamine - Streptocoque Pen 1% - HEPES 2% (1M) - La cellule endothéliale croissance de 7%supplément e (ECGS)	DMEM - 1% de L-glutamine - Streptocoque Pen 0,2%
Méthode Passage	1 x trypsine	Suspension	Gratter	1 x trypsine
Ratio Passage	03:10	01:03		01:20	01:03	01:03
Activation cellulaire (facultatif)		TO-901317 - LXR-agoniste - Conc final. 4 uM
Autres réactifs		phorbol 12-myristate 13-acétate (PMA) La différenciation cellulaire - - Conc final. 0.1μg/ml