Article de méthode

Une seule cellule de profilage de développer et d'âge mûr neurones de la rétine

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DOI :

10.3791/3824

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19 avril 2012

 , 
1Department of Genetics, Development and Cell Biology, Neuroscience Program, Iowa State University

Dans cet article

Résumé

Procédé pour l'isolement de cellules rétiniennes uniques et d'amplification ultérieur de leurs ADNc est décrite. Monocellulaires transcriptomique révèle le degré de l'actuelle hétérogénéité cellulaire dans un tissu et découvre de nouveaux gènes marqueurs de populations de cellules rares. Le protocole d'accompagnement peut être ajustée en fonction de nombreux types cellulaires différents.

Résumé

Populations hautement spécialisés, mais extrêmement faible de cellules jouent un rôle important dans de nombreux tissus. L'identification de la cellule de type marqueurs spécifiques et des programmes d'expression génique pour des sous-ensembles de cellules extrêmement rares a été un défi en utilisant des tissus entiers approches. Profilage de l'expression génique des cellules individuelles permet un accès sans précédent à des types cellulaires qui composent seulement un petit pourcentage de l'ensemble du tissu 1-7. En outre, cette technique peut être utilisée pour examiner les programmes de l'expression des gènes qui sont exprimés dans transitoirement un petit nombre de cellules au cours de dynamiques de développement des transitions 8.

Cette question de la diversité cellulaire se pose à plusieurs reprises dans le système nerveux central (SNC) où les connexions neuronales peuvent se produire entre les cellules très diverses 9. Le nombre exact de types cellulaires distincts n'est pas connue avec précision, mais il a été estimé qu'il pourrait y avoir jusqu'à 1000 différents types dans le cortex itself 10. La fonction (s) de circuits neuronaux complexes peut s'appuyer sur quelques-uns des types rares neurones et les gènes qu'ils expriment. En identifiant de nouveaux marqueurs et d'aider à classer les différents neurones moléculaire, l'approche unique de cellules est particulièrement utile dans l'analyse des types de cellules dans le système nerveux. Il peut aussi aider à élucider les mécanismes de développement du système nerveux par l'identification des gènes différentiellement exprimés et les voies de gènes au cours des étapes précoces du développement progéniteur neuronal.

En simple, le tissu facilement accessible avec la diversité neuronale considérable, la rétine des vertébrés est un excellent modèle pour étudier les processus de développement cellulaire, la différenciation neuronale et la diversification neuronale. Cependant, comme dans d'autres parties du système nerveux central, cette diversité cellulaire peut présenter un problème pour la détermination des voies génétiques qui conduisent progéniteurs rétiniens d'adopter un destin cellulaire spécifique, en particulier étant donné que les photorécepteurs tige forment le majorité de la population totale des cellules rétiniennes 11. Nous rapportons ici une méthode pour l'identification des transcrits exprimés dans les cellules rétiniennes simples (figure 1). La technique de profilage à cellule unique permet pour l'évaluation de la quantité de l'hétérogénéité au sein de différentes populations cellulaires de la rétine 2,4,5,12. En outre, cette méthode a révélé une foule de nouveaux gènes candidats qui pourraient jouer un rôle (s) dans le destin des cellules aux processus décisionnels qui se produisent dans des sous-ensembles de cellules progénitrices rétiniennes 8. Avec quelques ajustements simples du protocole, cette technique peut être utilisée pour de nombreux tissus différents et des types de cellules.

Protocole

1. Dissociation cellulaire

  1. Un organigramme décrivant le protocole qui est affiché est la figure 1. Pour les numéros de catalogue des réactifs particuliers utilisés dans le présent protocole, s'il vous plaît se référer au tableau 1. Disséquer la rétine dans un bain de PBS. Lors de la dissection, il est préférable d'enlever le vitré et la lentille depuis les garder avec la rétine peuvent entraver la dissociation. Il n'est pas toujours une importance cruciale pour supprimer tous les de l'épithélium pigmentaire rétinien (EPR) et, dans certains cas, il peut être impossible de le supprimer complètement. Toutefois, pour les simples expériences de profilage des cellules de photorécepteurs, l'EPR devrait être supprimée. Si vous n'enlevez pas l'EPR peut conduire à une contamination des profils de cellules de tige avec des RPE gènes exprimés. C'est probablement à cause de la connexion entre les photorécepteurs et l'EPR.
    Pour la dissociation, l'ensemble des adultes rétines de souris sont incubées à 37 ° C pendant 10 min dans un microtube de 1,5 ml contenant 20ul activé la papaïne, 20 pi 25 mM cystéine dans 5 mM d'EDTA, et 360 ul de solution saline équilibrée de Hank (HBSS) complétée par 10 mM de HEPES. Des pointes de pipette à bout filtre sont utilisés pour toutes les étapes à travers le protocole pour réduire au minimum la contamination potentielle. La concentration papaïne et le temps d'incubation varie en fonction de l'âge et la nature du tissu. Par exemple, de dissocier le développement rétines isolées au jour postnatal 0 (P0), incuber la rétine dans 10 ul papaïne activée, 10 pi 25 mM cystéine dans 5 mM d'EDTA, et 380 Solution ul saline équilibrée de Hank (HBSS) complétée par 10 mM d'HEPES pendant 10 min à 37 ° C. Rétines de différentes espèces requièrent également des conditions légèrement différentes. Rétines de poulet sont plus minces que la rétine de souris dans la plupart des stades de développement. Utilisation de 10 ul activé la papaïne, 10 pi 25 mM cystéine dans 5 mM d'EDTA, et la solution de 380 ul saline équilibrée de Hank (HBSS) complétée par 10 mM de HEPES pendant 5 min à 37 ° C est suffisante pour dissocier trétines Hese.
  2. Tapoter légèrement le tube pour déloger les cellules sédimentées, puis triturer doucement 10-20 fois avec une pipette P1000. Incuber pendant 10 min de plus à 37 ° C si de grosses touffes de tissu persistent et puis re-triturer 10-20 fois.
  3. Ajouter 5 ul de DNase I (10 U / pl) et incuber pendant 5 min à température ambiante. Triturer doucement avec une pipette P1000. Le nombre exact de fois devra être déterminé de manière empirique, mais se situe généralement entre 10-20.
  4. Centrifugeuse dans une centrifugeuse de table à 3000 tours par minute pendant 3 min Enlever le surnageant, laissant 100-200 pi de liquide au fond, puis sur le tube pour déloger la pastille. Ajouter 1 ml de HBSS et remettre en suspension le culot avec trituration douce. Exploiter le tube est critique ici comme une simple remise en suspension le culot avec beaucoup de lyser les cellules de la rétine. Cela est particulièrement vrai avec les adultes rétines de souris.
  5. Centrifuger à 3000 rpm pendant 3 min Retirer délicatement le surnageant et remettre en suspension dans 450 ul de PBS contenantBSA ment 0,1%. Il est important d'enlever autant de surnageant que possible afin de minimiser la présence d'ARNm de cellules lysées et les produits de la dissociation qui pourraient inhiber les réactions futures.

2. La récolte des cellules individuelles

  1. Préparer deux boîtes de 6 cm contenant 5 ml de PBS additionné de 0,1% de BSA. Plate les cellules dissociées sur une seule antenne et permettent aux cellules de se contenter d'au moins 5 min. La densité cellulaire utilisé dépend fortement de la nature des cellules individuelles étant profilées. Par exemple, pour les cellules très rares marqués avec un marqueur fluorescent une telle GFP, entières rétines dissociées sont étalées sur un plat unique de 6 cm. Pour les cellules qui sont un peu plus abondante, moins de cellules sont initialement ensemencées pour le rendre plus facile à récolter un (ou très proche de un) de cellules à la micropipette en premier.
  2. Placer la plaque de cellules dissociées sur un microscope inversé. Nous utilisons le modèle IMT-2 de l'Olympe. Utilisation de micropipettes qui ont été tirées à une fine pointe (diamètre intérieur de 0,5 mm, diamètre extérieur 1,04 mm) (figure 2) et avec un tube d'aspiration, la récolte d'une seule cellule. Les cellules facilement pénétrer dans la micropipette lorsqu'il est placé à proximité de leur sur le plat. Il est essentiel que le tube d'aspiration n'est ni trop long ni trop court pour la distance à l'étape associée avec le microscope inversé (Les tubes de prélèvement que nous utilisons avec notre microscope inversé sont 38,1 cm de long). Si le tube est trop long, les cellules ne peuvent être expulsés de manière efficace à partir de la micropipette dans le tube de collecte. La raison principale que nous utilisons plus l'IMT-2 modèle microscope inversé, c'est que nous avons trouvé qu'il a la distance idéale à la scène pour nos tubes d'assemblage d'aspiration. Après être entré dans la micropipette, la cellule (ou des cellules) est expulsé vers une seconde plaque (plaque de lavage) de sorte que un et un seul est récoltée pour profil d'expression génique. Sur la seconde plaque, il est souvent nécessaire pour éliminer les cellules superflues, soit avec une micropipette nouvelleou déplacer la cellule d'intérêt à un emplacement différent pour veiller à ce que d'une unique cellule entre dans la micropipette.
  3. Lorsque une cellule individuelle est complètement isolé des cellules voisines, utiliser une micropipette nouvelle pour aspirer la cellule d'intérêt que dans la section 2.2 et l'expulsent ensuite directement dans un tube de 0,2 ml PCR contenant 4,5 pi de tampon de lyse cellulaire. La cellule est expulsé sur le côté du tube, en faisant attention de ne pas rompre la pointe de la micropipette dans le tube. Les échantillons peuvent être filée brièvement dans une microcentrifugeuse de paillasse pour plonger la cellule dans un tampon de lyse. Cette filage se fait généralement après chaque cellule 5 et ensuite à nouveau à la fin de collection.Tubes contenant des cellules individuelles dans un tampon de lyse doit être maintenu dans la glace pendant la durée de l'isolement seule cellule. Pour des résultats optimaux, les cellules sont collectées dans une fenêtre de deux heures l'après-dissociation. Passé ce délai s'est écoulé, il est préférable de procéder à l'étape de transcription inverse puisque le temps supplémentaire a été observed pour augmenter les chances de la dégradation de l'ARN.

3. Transcription inverse

  1. Brièvement tourner les échantillons dans une surface de travail pour assurer minicentrifuge tous les cellules individuelles sont immergés dans le tampon de lyse cellulaire. Afin de promouvoir la lyse des cellules, incuber l'échantillon à 70 ° C pendant 90 sec. dans un thermocycleur. Placer immédiatement les tubes de retour sur la glace.
  2. Laisser reposer les tubes sur la glace pendant 2 min. Pour tous les ajouts de réactifs, utiliser le filtre à pointe des pointes de pipette pour éviter la contamination. Pour effectuer la transcription inverse, ajouter 0,33 ul Superscript III (200 U / pl), 0,05 pl inhibiteur de RNase (40 U / pl), et 0,07 ul gène 32 de T4 des protéines. Incuber le mélange réactionnel pendant 50 min à 50 ° C dans un thermocycleur. Inactiver l'enzyme à 70 ° C pendant 15 min et le lieu sur la glace.
  3. Pour enlever l'apprêt libre, ajouter 0,1 Tampon Exonuclease ul (10X), 0,8 pi dH 2 0 (qualité biologie moléculaire), et 0,1 ul exonucléase I (20 U / pl). Incuber à 37 ° C pendant 30 min dansun thermocycleur. Inactiver l'enzyme par incubation de la réaction à 80 ° C pendant 25 min, puis placer les tubes sur de la glace.

4. Tailing et des cellules individuelles PCR

  1. Ajouter 6 pi du mélange réactionnel de résidus et d'utiliser un thermocycleur à incuber l'échantillon à 37 ° C pendant 20 min, 70 ° C pendant 10 min, et le maintenir à 4 ° C
  2. Ajouter 10 ml de l'échantillon à queue au mélange réactionnel de PCR et d'effectuer la synthèse du second brin et l'amplification PCR en utilisant les conditions suivantes:
    1. 95 ° C pendant 2 min
    2. 37 ° C pendant 5 min
    3. 72 ° C pendant 16 min
    4. 93 ° C pendant 40 secondes
    5. 67 ° C pendant 1 min
    6. 72 ° C pendant 6 minutes, en ajoutant 6 secondes par cycle
    7. Passez à l'étape 4 34 fois
    8. 72 ° C pendant 10 min
    9. Maintenir à 4 ° C

5. Étiquetage pour les puces Affymetrix

  1. Étiquette 10-20 g d'ADNc (la concentration de l'ADNc amplifié résultatING à partir d'une seule cellule est généralement ~ 1 ug / ul) pour obtenir une hybridation sur puces Affymetrix robuste. Tout d'abord, un fragment de l'ADNc en ajoutant 10-20 ul de l'ADNc à cellule unique à 8 1X ul-One Phor-All tampon et 1 ul de dilution (1:10 dans 1X One-Phor-All tampon) DNaseI dans un 80 pi réactionnel. Incuber dans un thermocycleur pendant 13 min à 37 ° C. Désactiver la DNase I pendant 15 min à 100 ° C et le lieu sur la glace.
  2. Ajouter 20 ul de tampon TdT 5X, 2,5 pi biotine N6-ddATP (Enzo Biosciences), et 1 ul TdT (dilué 1:8 dans un tampon TdT).
  3. Incuber pendant 90 min à 37 ° C, puis 5 min à 65 ° C. Conserver à -20 ° C ou s'hybrider immédiatement à une puce à ADN Affymetrix. L'hybridation est réalisée en utilisant des protocoles standard d'Affymetrix.

6. Les résultats représentatifs

Pour évaluer la qualité de l'ADNc, pl 10 de l'échantillon d'ADNc a été chargé sur un gel d'agarose 1%. L'ADNc est principalement jugé par la gamme de taille (500-2000 pb)et l'intensité de l'étalement d'ADNc (Figure 1 et Figure 3a). Dans le gel décrite sur la figure 1, chaque voie de l'autre représente un frottis ADNc à partir de cellules rétiniennes isolée E16.5. Les voies entre montrent les frottis résultant lorsque les médias seulement est aspiré dans l'aiguille et déposés dans le tube de PCR. Ces voies ne sont jamais complètement dépourvue d'un frottis faible, mais ils ne montrent pas de résultats lors de gènes spécifiques des amorces de PCR sont utilisés pour amplifier les gènes de leur part. En outre, l'intensité de l'étalement d'ADNc peut varier quelque peu (comparer la figure 1 et figure 3a). Dans la figure 3A voies a, f, g, h et contiennent robustes frottis d'ADNc alors voies b, c, d et e sont considérablement moins robuste.

Spécifique du gène PCR est utilisé comme un écran secondaire de la qualité de l'ADNc à partir d'une seule cellule. Les ADNc de la figure 3 ont été isolés à partir fluorescentes cellules ganglionnaires de la rétine et ils étaient tested en utilisant des amorces de PCR pour la rétine marqueurs des cellules ganglionnaires Brn3b et Pax6. Pour cet essai, 1 pl de l'ADNc a été soumis à une PCR pendant 30 cycles. Real-PCR quantitative en temps serait un test de préférence, mais il peut être prohibitif et n'est pas nécessaire pour la simple évaluation de la qualité d'ADNc. Tous les 8 des cellules individuelles ont été testés positifs pour Brn3b et 6 à 8 pour Pax6 (Figure 3b). Même les frottis d'ADNc qui ont été moins robustes bandes produites pour Brn3b et Pax6. En dépit de ces résultats de la PCR, il est de notre expérience que les frottis d'ADNc tels que ceux dans les couloirs b, c, d et e ne donnent pas hybridations robustes sur Affymetrix et sont généralement évités. Gene PCR spécifique pour la Crx photorécepteur marqueur a été utilisé pour déterminer le niveau de contamination dans les ADNc seule cellule (figure 3b). Un marqueur photorécepteur a été choisi parce que ces cellules constituent la majorité de la rétine (~ 70%) et, par conséquent, toute la lyse des cellules qui ont eu lieu très probablement impliquer tige photoreceptors. Il y avait seulement une quantité faible de l'actuelle Crx dans ces préparations d'ADNc, même après 30 cycles de PCR. Enfin, cet écran reposant sur la PCR peut être utilisée pour commencer à déterminer les sous-ensembles d'un type cellulaire particulier les ADNc ont été dérivés à partir avant de les soumettre à un profilage microréseau intégral. Cela peut aider à prioriser les cellules qui sont profilées, car c'est l'étape la plus coûteuse dans le processus. Par exemple, nous avons identifié des sous-ensembles de cellules ganglionnaires de la rétine par eux le dépistage de la présence du gène Tachykinin1 (Figure 3b).

De la petite à base de PCR écran, notamment des cellules simples sont choisis et leurs ADNc hybridé à un microréseau Affymetrix. Les données microarray est comparé et les modèles peuvent être découverts en utilisant des algorithmes de clustering standards. Heatmaps, comme dans la figure 4, sont générées pour représenter graphiquement les données. Il ya deux principales conclusions concernant les données de profilage simples cellules de la figure4. Tout d'abord, les gènes exprimés dans des types cellulaires spécifiques se trouvent presque exclusivement dans ces types cellulaires après le protocole de cellule unique est effectué. Dans la plupart des cas où les gènes marqueurs d'un type de cellule se trouvent également dans un second type de cellules, telles que l'observation que les cellules bipolaires exprimer certains gènes «bâtonnet» à des niveaux inférieurs, cette expression dans le second type de cellules est facilement confirmé par soit in situ hybridation ou marquage par anticorps. Deuxièmement, au sein de la amacrines plus diversifiée et profils des cellules ganglionnaires, l'hétérogénéité de l'expression génique est immédiatement apparent. Pou4f1 est exprimé uniquement dans environ 1/4 des cellules ganglionnaires en développement, tout en NR4A2 et Scube2 sont deux exemples de gènes exprimés dans différents hétérogène des cellules amacrines. En fait, les gènes indiqués dans le heatmap sont juste un petit échantillon que plusieurs centaines de gènes ont été identifiés et confirmés en tant que marqueurs de cellules ganglionnaires en développement ou en tant que marqueurs de différentes populations de cellules amacrines 2,4.

figure-protocol-1
Figure 1. Organigramme de la méthode de profilage seule cellule. Rétines Premières sont isolées et dissociées en cellules individuelles en utilisant la papaïne. Deuxièmement, les cellules sont récoltées avec une aiguille de verre tiré et déposé dans des tubes PCR. Les cellules sont lysées et l'ADNc amplifié en utilisant une transcription inverse suivie par PCR. La qualité ADNc résultant est évaluée sur un gel d'agarose tel que celui montré. Après l'échelle d'ADN dans la première voie, les voies montrent frottis d'ADNc à partir des cellules individuelles (indiqué par les parenthèses rouges) alternant avec des produits d'amplification de contrôle des médias. Les frottis de cette qualité (entre parenthèses rouges) sont hybridées aux puces Affymetrix.

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Figure 2. Photos des aiguilles et l'assemblage tube aspirateur. Cellules individuelles sont isolées en utilisant l'action capillaire d'untiré de verre micropipette (diamètre intérieur 0,5 mm, diamètre extérieur 1,04 mm) et sont transférées par la pression de soufflage dans l'aspirateur. Il est important que le tube d'aspiration est à la fois assez longtemps pour manipuler facilement et assez courte pour s'acquitter de manière fiable des cellules individuelles. Une vue rapprochée du tube capillaire tiré dans une aiguille est indiqué dans B.

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Figure 3. Donner un exemple représentatif des frottis de cellules uniques d'ADNc et PCR de gènes spécifiques. Pour déterminer la qualité de la cellule unique d'ADNc après amplification, 10 ul de chaque échantillon cellule unique ont été exécutés sur un gel d'agarose 1% avec un contrôle négatif (A). Un frottis devrait apparaître entre 500-2000 pb. Supplémentaire basée sur la PCR de dépistage des gènes spécifiques peuvent aider à identifier / confirmer le type de cellule qui a été isolé et la quantité de contamination de l'échantillon (B). Des amorces spécifiques de la cellule ganglionnaire de la rétine marqueurs Brn3bet Pax6 ont été testés pour confirmer l'identité de ces cellules (lignes 1 et 2). Pour évaluer le montant de la contamination photorécepteur dans la préparation, des amorces spécifiques pour la Crx photorécepteur marqueur ont été utilisés (ligne 3). Sous-ensembles de cellules ganglionnaires peuvent également être identifiés par le dépistage des marqueurs tels que Tachykinin1 (ligne 4).

figure-protocol-4
Figure 4. L'expression cellule unique d'un des gènes marqueurs. Les résultats microarray de gènes sélectionnés exprimées dans des cellules individuelles distinctes 22 sont présentés dans un format heatmap. Les intensités de signaux des puces ont été mis à l'échelle pour correspondre à l'intensité de la couleur rouge. Le noir indique l'absence de signal sur la puce. Les rétiniennes ganglionnaires de cellules (RGC) précurseurs indiqués ont été isolés à partir de points de temps embryonnaires, tandis que les autres cellules ont été isolées à partir de rétines adultes.

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Discussion

Un nombre sans cesse croissant d'études révèlent robustes cellule à cellule variabilité des populations que l'on croyait à être plus homogènes en ce qui concerne leur expression génique 6,8. Dans un cas au moins, cette expression du gène du «bruit» a été montré à jouer un rôle important biologique 13. Différences d'expression des gènes entre les cellules individuelles sont obscurcies à l'aide de tissus traditionnels ensemble des méthodes. Ces expériences de générer le profil d'e...

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Déclarations de divulgation

Pas de conflits d'intérêt déclarés.

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