Un test de dépistage fluorescent pour identifier des modulateurs de canaux Girk

Résumé

Une procédure de dépistage en temps réel pour identifier les médicaments qui interagissent avec la protéine G-dépendants vers l'intérieur K redresseur ⁺ (Girk) canaux est décrite. Le test utilise le potentiel de membrane-colorants fluorescents sensibles pour mesurer l'activité du canal Girk. Cette méthode est adaptable pour une utilisation sur un certain nombre de lignes de cellules.

Résumé

Aux protéines G-dépendants vers l'intérieur de redresseur ^K + (Girk) canaux fonctionnent en tant que médiateurs cellulaires d'un large éventail d'hormones et de neurotransmetteurs et sont exprimés dans le cerveau, le cœur, le muscle squelettique et le tissu endocrinien ^1,2. Canaux Girk sont activés suite à la liaison des ligands (neurotransmetteurs, des hormones, médicaments, etc) pour leur plasma liée à la membrane, couplés aux protéines G (RCPG récepteurs). Cette fixation provoque la stimulation de protéines G (G _i et G _o) qui se lient à la suite et d'activer le canal de Girk. Une fois ouvert le canal Girk permet le mouvement de K ⁺ hors de la cellule provoquant la membrane de repos potentiel pour devenir plus négative. En conséquence, l'activation du canal dans les neurones diminue Girk spontanée formation potentielle d'action et inhibe la libération de neurotransmetteurs excitateurs. Dans le cœur, l'activation du canal Girk inhibe l'activité pacemaker ce qui ralentit le rythme cardiaque. 3. Toutefois, la pharmacologie de ces canaux reste largement inexploré. Bien qu'un certain nombre de médicaments, y compris les agents anti-arythmiques, les médicaments antipsychotiques et les antidépresseurs bloquent le canal Girk, cette inhibition n'est pas sélective et se produit à des concentrations relativement élevées de médicaments ^3.

Ici, nous décrivons un test de dépistage en temps réel pour identifier les nouveaux modulateurs de canaux Girk. Dans cet essai, neuronales AtT20 cellules, exprimant les canaux Girk, sont chargés de potentiel de membrane colorants fluorescents sensibles tels que le bis-(1,3-dibutylbarbituric acide) triméthine oxonol [DiBAC ₄ (3)] ou HLB 021-152 (Figure 1 ). Les molécules de colorant devient fortement fluorescent absorption suivant dans les cellules (Figure 1). Traitementdes cellules avec des ligands GPCR stimule les canaux Girk à ouvrir. Le résultant efflux de K ⁺ hors de la cellule provoque le potentiel de membrane à devenir négative et le signal fluorescent de diminuer (figure 1). Ainsi, les médicaments qui modulent efflux de K ⁺ à travers le canal Girk peut être dosé en utilisant un lecteur de plaque fluorescente. Contrairement à d'autres tests de dépistage d'ions de canal, comme la spectrométrie d'absorption atomique ⁴ ou radiotraceur analyse ^5, le test de canal Girk fluorescente fournit une procédure de dépistage rapide, en temps réel et peu coûteux.

Protocole

1. Préparation des cellules

1. Cultiver l'hypophyse AtT20 cellules dans un milieu Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) supplémenté avec du sérum de cheval 10% et de maintenir les cultures à 37 ° C dans une atmosphère humidifiée de 5% de CO _2.
2. Maintenir la culture par repiquage des cellules toutes les 5 à 7 jours en utilisant une procédure standard de traitement à la trypsine.
3. Enrober les puits de noir, fond transparent, des plaques à 96 puits avec 50 pl de poly-L-lysine. Laisser sécher les puits pendant 30 min dans l'incubateur.
4. Plaque des cellules dans les plaques à 96 puits contenant 200 ul médias à une densité ....

Discussion

Bien que le potentiel de membrane-colorants fluorescents sensibles ont été utilisés pour identifier les médicaments qui modulent les canaux ioniques ^9,10, c'est le premier rapport de leur demande de neurones Girk drogues Discovery Channel. Le test de canal Girk fluorescente présentée ici fournit une méthode rapide, fiable et en temps réel pour le criblage de ligand-dépendants canaux ^K +. Le dosage peut être modifié pour une utilisation avec une large gamme de cellules, y compris des lignées cel.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Nom du réactif	Entreprise	Numéro de catalogue
DMEM	Cellgro	10-013
Sérum de cheval	Invitrogen	16050-114
Plaques à 96 puits	Corning	3603
Poly-L-lysine	Sigma-Aldrich	P4707
La somatostatine	Sigma-Aldrich	S9129
Carbachol	Sigma-Aldrich	C4382
HLB 021-152	AnaSpec	89300
Gestionnaire Versette liquide automatisé	ThermoFisher	650-01
Synergy2 lecteur de plaque fluorescente	Biotek
Gen5 analyse sLOGICIEL	Biotek

Tableau 1. Table des réactifs spécifiques et des équipements.