Cet article présente une technique pour la collecte de sang de l'aorte dorsale du poisson zèbre. Il fournit également des instructions pour l'obtention du sérum pour une utilisation dans les analyses biochimiques, tels que les tests pour déterminer le taux de cholestérol et de triglycérides.
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Article de méthode
Collecte de sang pour analyse biochimique chez le poisson zèbre adulte
Dans cet article
Résumé
Résumé
Le poisson zèbre a été utilisé comme modèle animal pour les études de plusieurs maladies humaines. Il peut servir de plate-forme puissante pour les études précliniques d'événements moléculaires et stratégies thérapeutiques ainsi que pour évaluer les mécanismes physiologiques de certaines pathologies 1.
Il ya relativement peu de publications relatives à la physiologie du poisson zèbre adulte d'organes et de systèmes 2, qui peuvent conduire les chercheurs à conclure que les techniques de base nécessaires pour permettre l'exploration des systèmes de poisson-zèbre manque 3. Hématologiques valeurs biochimiques de poisson zèbre ont d'abord été signalé en 2003 par Murtha et 4 collègues qui a employé une technique de collecte de sang d'abord décrit par Jagadeeswaran et ses collègues en 1999. En bref, le sang a été recueilli par une pointe micropipette par une incision latérale, environ 0,3 cm de longueur, dans la région de l'aorte dorsale 5. En raison des dimensions minute en cause, ceest une technique de haute précision nécessitant un praticien hautement qualifiée. La même technique a été utilisée par le même groupe dans une autre publication dans cette même année 6. En 2010, Eames et ses collègues ont évalué l'ensemble de la glycémie chez le poisson zèbre 7. Ils ont eu accès à du sang en effectuant décapitations avec des ciseaux, puis l'insertion d'un tube de prélèvement hépariné microcapillaire dans l'articulation pectorale. Ils mentionnent des difficultés avec l'hémolyse qui ont été résolus avec une température de stockage appropriée basée sur le travail Kilpatrick et al. 8. Lorsque vous tentez d'utiliser la technique du Jagadeeswaran dans notre laboratoire, nous avons constaté qu'il était difficile de faire l'incision précisément dans le bon endroit pour ne pas permettre à une quantité importante de sang à perdre avant la collecte pourrait être lancé.
Récemment, Gupta et al. 9 décrit comment disséquer les organes de poisson zèbre adulte, Kinkle et al. 10 décrit comment effectuer intraperitoninjections EAL, et Pugach et al. décrit 11 comment effectuer rétro-orbitaires injections. Cependant, plus de travail est nécessaire pour explorer plus à fond les techniques de base pour la recherche chez le poisson zèbre.
La petite taille du poisson zèbre présente des défis pour les chercheurs qui l'utilisent comme un modèle expérimental. En outre, compte tenu de cette petitesse de l'échelle, il est important que les techniques simples sont mis au point pour permettre aux chercheurs d'explorer les avantages du modèle de poisson zèbre.
Protocole
1. Texte du Protocole
- Avant la collecte de sang le poisson-zèbre, il est nécessaire de préparer de l'eau anesthésiante. Verser ~ 200 ml d'eau de l'aquarium dans un récipient d'une capacité de 500 ml. Ajouter ~ 200 g de morceaux de glace. La température devrait être d'environ 4 ° C. Comme les morceaux de glace fondre, il sera nécessaire d'ajouter des morceaux de glace de plus pour maintenir une température constante de près de 4 ° C.
- Lorsque l'eau anesthésiante est prêt, préparer le matériel nécessaire pour la collecte de sang. Mettre une pointe à faible rétention sur une pipette P20 et laisser la pipette où il peut être facilement accessible. Ne laissez pas la pointe de pipette à contacter toutes les sources de contamination.
- Couvrir une boîte de Pétri avec un morceau de gaze sèche. Une lame en acier et un autre morceau de gaze doit être placé dans un endroit facilement accessible.
- Une centrifugeuse adaptée pour tubes en matière plastique sera nécessaire.
- Lorsque les matières mentionnées ci-dessus sont préparés, de capturer le poisson-zèbre premier à être anesthésié l'espritfilet de pêche ha et le libérer dans l'eau qui a été préparé pour l'anesthésie. Le poisson zèbre exigent 3-6 s dans l'eau glacée d'être anesthésié, selon le poisson. Gardez le poisson dans l'eau froide jusqu'à ce qu'elle ne répond plus aux stimuli externes.
- Utilisation de la pêche au filet, placer le poisson anesthésié sur un morceau de gaze préparée, en laissant la queue hors de la gaze. Pliez la gaze sur la tête du poisson et du corps en laissant de côté que sa queue. Mettez le poisson recouvert de la toile sur la boîte de Pétri.
- Utilisez la lame d'acier pour faire une incision en diagonale juste entre la nageoire anale et la nageoire caudale. Le sang va commencer à sortir. À ce stade, il est nécessaire de travailler rapidement.
- Doucement aspirer le sang qui sort avec la pipette P20 (pré-chargé avec une pointe à faible rétention). La quantité de sang qui peuvent être recueillis dépend de la taille du poisson et dans quelle mesure qu'il a été anesthésié correctement. Il varie généralement de 5 à 20 pi. Lorsque le sang cesse de coming, doucement transférer le sang aspiré dans un tube.
- Pour éviter l'hémolyse, il est essentiel que le tube de sang en elle être traitée avec beaucoup d'attention, sans aucun mouvement drastiques jusqu'à ce qu'il soit placé dans la centrifugeuse.
- Pour éviter l'hémolyse, il est également important que l'échantillon de sang être fixé dans la centrifugeuse dans les 10 minutes suivant le prélèvement de sang.
- Si nécessaire, il est possible de combiner le sang de plus d'un animal, ce qui rend une piscine. Les échantillons combinés fonctionnera bien tant que le délai entre la collecte de sang du premier poisson et la centrifugation ne dépasse pas 10 minutes.
- Lorsque la collecte de sang est faite, centrifuger le sang pendant 10 minutes à 0,5 g (centrifugeuse Eppendorf 5415D).
- Après centrifugation, le sérum est moins la couche supérieure du tube. Avec une pipette, aspirer le sérum, en veillant à obtenir simplement le sérum tout en gardant les deux couches bien divisé et stable.
- Transférer le sérum dans un microtube nouvelle et ilest prêt à être utilisé dans des analyses biochimiques. Le sérum peut être conservé dans la glace alors qu'il hâte de commencer les analyses biochimiques.
- Si le sérum ne sera pas utilisé immédiatement, il peut être congelé à -18 ° C jusqu'à environ 3 mois.
2. Les résultats représentatifs
Il était possible de collecter 5 à 20 ul de sang total de chaque poisson représente ce que le sang même 4 fois plus que les techniques décrites précédemment (tableau 2). L'analyse biochimique du cholestérol total, HDL-cholestérol, le LDL-cholestérol et les triglycérides ont été effectuées après la collecte de sang en utilisant cette technique. Deux groupes de deux poissons sexes ont jeûné pendant 24 heures avant la collecte du sang pour éviter les interférences apport alimentaire. Les analyses ont été effectuées avec les petits-échelle des tests colorimétriques (Labtest Diagnostica SA, Brésil) pour des analyses de cholestérol et de triglycérides totaux, 3 pl de sérum ont été utilisés. Pour le cholestérol LDL et HDL-cholestéroll'analyse, 4 pi et 10 pi de sérum ont été utilisés, respectivement. Ces analyses ont été effectuées sur des échantillons mis en commun de 10 poisson zèbre par échantillon.
Les taux sériques de lipidiques ont été comparés entre les poissons qui a accédé à leurs propres oeufs et ceux qui, dans un aquarium de fond recouvert, n'ont pas eu accès à leurs propres oeufs pour une durée expérimentale de 2 semaines. L'analyse du sérum a montré que les taux sériques de cholestérol total (avec des oeufs 362 ± 42 mg / dL et sans oeufs 357 ± 13 mg / dL), les taux de HDL-cholestérol (avec des oeufs 91,22 ± 1,79 mg / dL et sans oeufs 72,14 ± 2,89 mg / dL), et le LDL-cholestérol (avec des oeufs 55,68 ± 10,88 mg / dL et sans oeufs 44,18 ± 9,84 mg / dL) ne diffèrent pas significativement entre les groupes. Toutefois, le taux de triglycérides étaient significativement plus faibles dans le groupe expérimental (sans oeufs 292 ± 64 mg / dL) que dans le groupe de contrôle (avec des oeufs 457 ± 25 mg / dL, p = 0,03).
| & Nbsp; | Avec l'accès aux œufs | Sans accès aux œufs |
| Cholestérol total (mg / dL) | 362,82 ± 73,11 | 357,69 ± 23,08 |
| LDL - Cholestérol (mg / dL) | 55,69 ± 18,84 | 44,19 ± 17,05 |
| HDL - Cholestérol (mg / dL) | 91,23 ± 3,11 | 72,14 ± 5,01 |
| Les triglycérides (mg / dL) | 457,64 ± 43,78 * | 292,36 ± 111,28 |
Tableau 1. Le cholestérol et les triglycérides sériques niveaux pour les deux groupes étudiés (avec accès aux œufs et sans accès aux œufs), exprimée en moyenne ± déviation standard.
* Statistiquement significatif (p = 0,03). Test t de Student.
| Aut hors | Lieu de l'incision | La méthode de récolte | Anesthésie | Montant de sang prélevé |
| Jagadeeswaran et. al., 1999 Murtha et al., 2003 | Postérieure dissection Micro nageoire dorsale | Micropipette | Non mentionné MS222 3% dans de l'eau froide | 1 a 5 pl 5 a 10 pi |
| Eames et al., 2010 | Décapitation | Micro tube de capillaires | MS222 0,02% 28 ° C l'eau | 5 a 10 pi |
| Présente étude | Incision entre la nageoire anale et la nageoire caudale | Micropipette et des conseils de conservation à faible | Puces d'eau et de glace | 5 a 20 pi |
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Discussion
Cet article présente une technique simple qui permet en outre de sang et l'analyse du sérum dans les expériences de poisson-zèbre. Cette technique a le potentiel de contribuer aux études de poisson zèbre futures hématologiques nécessitant des données de paramètres sanguins. Elle devrait également permettre de plus grandes applications du poisson zèbre comme modèle expérimental.
Cette technique ne nécessite pas de compétences particulières ou de mise en œuvre d'une technique précise. ...
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Déclarations de divulgation
Pas de conflits d'intérêt déclarés.
Remerciements
FIPE / HCPA - Fundo de Incentivo une Pesquisa e Eventos
CAPES - coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nivel Superior
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Nom du réactif | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
| Conseils faible taux de rétention | Applied Biosystems | 022493020 | |
| 5415D centrifugeuse Eppendorf | Eppendorf | Supprimé |
Références
- Schneider, A. C. R., dos Santo, J. L., Porawski, M., Schaefer, P. G., Maurer, R. L., Matte, U., da Silveira, T. R. Implementação de um novo modelo de experimentação animal Zebrafish. Rev. HCPA. 29, 100-103 (2009).
- Briggs, J. P. The zebrafish: a new model organism for integrative physiology. Am. J. Physiol. Regulatory Integrative Comp. Physiol. 282, 3-9 (2002).
- Menke, A. L., Sptsbergen, J. M., Wolterbeek, A. P. M., Woutersen, R. A. Normal anatomy and histology of adult Zebrafish. Toxicologic Pathology. 000, 1-16 (2011).
- Murtha, J. M., Qi, W., Keller, E. T. Hematologic and serum biochemical values for Zebrafish. Comp. Med. 53, 37-41 (2003).
- Jagadeeswaran, P., Sheehan, J. P., Craig, F. E., Troyer, D. Identification and characterization of zebrafish thrombocytes. Br. J. Haematol. 107, 731-738 (1999).
- Jagadeeswaran, P., Sheehan, J. P. Analysis of blood coagulation in the zebrafish. Blood Cells Mol. Dis. 25, 239-249 (1999).
- Eames, S. C., Philipson, L. H., Prince, V. E., Kinkel, M. D. Blood sugar measurement in zebrafish reveals dynamics of glucose homeostasis. Zebrafish. 7, 205-213 (2010).
- Kilpatrick, E. S., Rumley, A. G., Rumley, C. N. The effect of haemolysis on blood glucose meter measurement. Diabet. Med. 12, 341-343 (1995).
- Gupta, T., Mullins, M. C. Dissection of Organs from the Adult Zebrafish. J. Vis. Exp. (37), e1717(2010).
- Kinkel, M. D., Eames, S. C., Philipson, L. H., Prince, V. E. Intraperitoneal Injection into Adult Zebrafish. J. Vis. Exp. (42), e2126(2010).
- Pugach, E. K., Li, P., White, R., Zon, L. Retro-orbital Injection in Adult Zebrafish. J. Vis. Exp. (34), e1645(2009).
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Réimpressions et autorisations
