C'est une méthode rapide et complète de l'immunophénotypage myéloïdes dérivées des cellules suppressives (MDSC) et l'enrichissement de Gr-1 + Leucocytes de la rate de souris. Cette méthode utilise la cytométrie en flux et cellulaire autoMACS tri pour enrichir viable Gr-1 + Leucocytes avant tri par FACS du MDSC pour une utilisation In vivo Et In vitro Tests.
Un abonnement JoVE est requis pour visualiser ce contenu. Connectez-vous ou commencez votre période d'essai gratuite.
Article de méthode
Préparation de dérivés myéloïdes cellules suppressives (MDSC) de Naive et pancréatique souris porteuses de tumeurs par cytométrie en flux et automatisé de tri magnétique de cellules activées (autoMACS)
Dans cet article
Résumé
Résumé
MDSC sont une population hétérogène de macrophages, les cellules dendritiques immatures et des granulocytes qui s'accumulent dans les organes lymphoïdes dans des conditions pathologiques, y compris les infections parasitaires, l'inflammation, le stress traumatique, réaction du greffon contre l'hôte, le diabète et le cancer 1-7. Chez la souris, MDSC expresse Mac-1 (CD11b) et Gr-1 (Ly6G et Ly6C) antigènes de surface 7. Il est important de noter que MDSC sont bien étudiés dans divers porteurs d'une tumeur hôtes où ils sont sensiblement élargies et réprimer les anti-tumoraux des réponses immunitaires par rapport à leurs homologues naïfs 7-10. Toutefois, en fonction de l'état pathologique, il ya différentes sous-populations de MDSC avec des mécanismes distincts et les cibles de la répression 11,12. Par conséquent, des méthodes efficaces pour isoler des populations viables MDSC sont importants dans l'élucidation de leurs différents mécanismes moléculaires de la suppression in vitro et in vivo.
Récemment, le Ghansah groupe a signalé l'expansion de la MDSC dans un modèle murin du cancer du pancréas. Notre porteur de tumeurs MDSC afficher une perte de l'homéostasie et augmentation de la fonction suppressive par rapport à naïve MDSC 13. Pourcentages MDSC sont beaucoup moins dans les compartiments lymphoïdes de souris naïves vs porteur de tumeurs. Il s'agit d'une mise en garde majeure, qui empêche souvent les analyses comparatives précises de ces MDSC. Par conséquent, l'enrichissement de Gr-1 + leucocytes chez des souris naïves avant le tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) améliore la pureté, la viabilité et réduit considérablement le temps de tri. Toutefois, l'enrichissement de la Gr-1 + leucocytes de souris porteuses de tumeurs est facultative car ceux-ci sont en abondance pour FACS rapides de tri. Par conséquent, dans ce protocole, nous décrivons une méthode très efficace de immunophénotypage MDSC et enrichissante Gr-1 + leucocytes de la rate de souris naïves pour le tri MDSC en temps opportun. Immunocompétents souris C57BL / 6 sont inoculés avec murin Panc02 CElls voie sous-cutanée alors que les souris naïves recevoir 1XPBS. Environ 30 jours après l'inoculation; rates sont récoltées et transformées en une seule cellule suspensions en utilisant un tamis de dissociation cellulaire. Les splénocytes sont ensuite globules rouges (RBC) lysées et une aliquote de ces leucocytes sont colorés en utilisant conjugués au fluorochrome des anticorps contre Mac-1 et Gr-1 à des pourcentages immunophénotype MDSC par cytométrie en flux. Dans une expérience parallèle, les leucocytes entiers de souris naïves sont colorées avec fluorescente conjugués GR-1, incubées avec des anticorps PE-microbilles et sélectionné de façon positive à l'aide un système automatisé de tri magnétique de cellules activées (autoMACS) Pro Separator. Ensuite, une aliquote de GR-1 + de leucocytes sont colorés avec Mac-1 anticorps pour identifier les l'augmentation des pourcentages MDSC par cytométrie en flux. Maintenant, ces Gr1 + de leucocytes enrichis sont prêts pour tri par FACS du MDSC à être utilisé dans les analyses comparatives (naïve vs porteur de tumeurs) in vivo et in vitro
Protocole
Avant de commencer, préparer les solutions suivantes:
3% de coloration des médias (SM):
-3% De sérum bovin foetal (FBS) dans 1X tampon phosphate salin (PBS)
MACS tampon (Mo):
- 0,5% d'albumine de sérum bovin (BSA) dans 1XPBS
1. Les rates de récolte provenant de souris
- Voie sous-cutanée d'injecter 6-8 semaines d'âge C57BL / 6 souris (Harlan) avec 1,5 x 10 5 murins Panc02 cellules en suspension dans 100 ul de PBS 1x (porteur de tumeurs; TB). Les souris témoins (N....
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Discussion
Il s'agit d'une méthode détaillée pour le traitement et immunophentyping populations MDSC qui est applicable à différents tissus lymphoïdes de modèles animaux différents. En particulier, l'enrichissement autoMACS peut être utilisé pour l'isolement des différents populations de leucocytes comprenant Gr-1 épuisement des splénocytes 4, la purification de sous-ensembles à partir de splénocytes myéloïdes et les ganglions lymphatiques 5, isolement de la moelle osseuse neutrophiles 14.......
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Déclarations de divulgation
Pas de conflits d'intérêt déclarés.
Remerciements
Nous reconnaissons le flux USF cytométrie Core Facility. Nous tenons à remercier le Dr Denise Cooper pour le partage des ressources. Nous aimerions également remercier Maya Cohen, Laura Pendleton et Diana Latour pour leur aide dans la mise en place et le tournage de cette vidéo. NN soutenu par la NSF FG-LSAMP pont à la bourse de doctorat DRH # 0929435. Ce travail a été financé par l'American Cancer Society Research Grant # institutionnel 93-032-13/Moffitt Cancer Center attribué à TG.
....Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| REACTIF | SOCIÉTÉ | Catalogue | COMMENTAIRES |
| Phosphate Buffered Saline 1X | Thermo Scientific Hyclone | SH30028.02 | Ca 2 + / Mg 2 + / rouge de phénol libre |
| L'albumine de sérum bovin (BSA) | Sigma-Aldrich | A7906 | Laissez dissoudre BSA intacte dans du PBS; Environnement stérile |
| Sérum de veau fœtal (FBS) | Thermo Scientific Hyclone | SV3001403HI | Inactivé par la chaleur; Environnement stérile |
| Rat anti-souris CD16/32 anticorps monoclonal (Fc Bloquer) | BD Biosciences | 553142 | Environnement stérile |
| Anti-souris CD11b (Mac-1) FITC | eBiosciences | 11-0112 | StérileEnvironnement |
| Anti-souris Ly6G (Gr-1) APC | eBiosciences | 17-5931 | Environnement stérile |
| Anti-souris Ly6G (Gr-1) PE | eBiosciences | 12-5931 | Environnement stérile |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | Environnement dilution en série stérile |
| Dissociation cellulaire Sieve | Sigma-Aldrich | CD1-1kt | Autoclave avant utilisation |
| 70-um crépine | BD Biosciences | 352350 | Environnement stérile |
| Tampon de lyse 1X RBC | eBiosciences | 00-4333-57 | Chaud à la température ambiante avant utilisation; Environnement stérile |
| Des boîtes de Pétri | Fisher Scientific | 08-757-12 | Environnement stérile |
| 50ml contubes iCal | Thermo Scientific | 339652 | Environnement stérile |
| 5ml 12X75mm tubes en polystyrène fond rond | BD Biosciences | 352054 | Connu sous le nom tubes FACS; Environnement stérile |
| 96 puits à fond en V plaques | Corning | 3897 | Environnement stérile |
| Bleu de Trypan | Cellgro | 25-900-CI | Environnement stérile |
| PE Microbilles | Miltenyi Biotec | 130-048-801 | Environnement stérile |
| AutoMACS Pro Separator | Miltenyi Biotec | 130-092-545 | |
| Colonnes autoMACS | Miltenyi Biotec | 130-021-101 | |
| AutoMACS course tampon | Miltenyi Biotec | 130-091-221 |
Références
- Goni, O., Alcaide, P., Fresno, M. Immunosuppression during acute Trypanosoma cruzi infection: involvement of Ly6G (Gr1(+))CD11b(+) immature myeloid suppressor cells. Int. Immunol. 14, 1125-1134 (2002).
- Zhu, B.
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Réimpressions et autorisations
