Article de méthode

Imagerie multimodale d'implantation de cellules souches dans le système nerveux central de souris

DOI :

10.3791/3906

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13 juin 2012

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1Laboratory of Experimental Hematology, University of Antwerp, 2Bio Imaging Lab, University of Antwerp

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cet article décrit une séquence d'événements optimisé pour l'imagerie multimodale de greffons cellulaires dans le cerveau des rongeurs en utilisant: (i) de la bioluminescence in vivo et l'imagerie par résonance magnétique, et (ii) post mortem analyse histologique. La combinaison de ces modalités d'imagerie sur un seul animal permet cellulaire d'évaluation du greffon avec une résolution, la sensibilité et une spécificité élevées.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Au cours de la dernière décennie, la transplantation de cellules souches a suscité un intérêt croissant en tant que modalité thérapeutique primaire ou secondaire pour une variété de maladies, à la fois dans les études précliniques et cliniques. Toutefois, à ce jour les résultats concernant les résultats fonctionnels et / ou la régénération des tissus après la transplantation de cellules souches sont très variés. En règle générale, un bénéfice clinique est observé sans une profonde compréhension du mécanisme sous-jacent (s) 1. Par conséquent, des efforts multiples ont conduit à l'élaboration des différentes modalités d'imagerie moléculaire pour contrôler la greffe de cellules souches dans le but ultime d'évaluer avec précision la survie, le destin et la physiologie des cellules souches greffées et / ou de leur micro-environnement. Les changements observés dans un ou plusieurs paramètres déterminés par l'imagerie moléculaire pourrait être liée à l'effet observé clinique. Dans ce contexte, nos études portent sur l'utilisation combinée de l'imagerie par bioluminescence (BLI), imagerie par résonance magnétique (IRM) et histologiques analysis pour évaluer les cellules souches de greffage.

BLI est couramment utilisé pour effectuer de façon non invasive suivi de cellules et de surveiller la survie des cellules dans le temps après une transplantation 2-7, basé sur une réaction biochimique dans laquelle les cellules exprimant le gène de la luciférase-rapporteur sont capables d'émettre de la lumière d'interaction suivant avec son substrat (par exemple D- luciférine) 8, 9. IRM d'autre part est une technique non invasive qui est cliniquement applicable 10 et peut être utilisé pour localiser précisément des greffes cellulaires à très haute résolution 11-15, même si sa sensibilité dépend fortement le contraste généré après marquage des cellules avec un agent de contraste IRM . Enfin, post-mortem analyse histologique est la méthode de choix pour valider les résultats de recherche obtenus avec des techniques non invasives avec la plus haute résolution et la sensibilité. Par ailleurs point final analyse histologique nous permet d'effectuer une analyse détaillée des phénotypique des cellules greffées et / ou les tissus environnants, based sur l'utilisation des protéines rapporteurs fluorescents et / ou d'étiquetage directe de la cellule avec des anticorps spécifiques.

En résumé, nous avons ici démontrer visuellement les complémentarités de BLI, l'IRM et l'histologie de démêler les cellules souches et différente / ou de l'environnement associée à des caractéristiques suivantes sur les cellules souches de greffage dans le SNC de la souris. A titre d'exemple, la moelle osseuse de cellules dérivées du stroma, génétiquement modifiées pour exprimer la protéine fluorescente verte améliorée (eGFP) et la luciférase de luciole (fluctuations), et étiquetés avec le bleu fluo de taille micronique des particules d'oxyde de fer (MPIOs), seront greffés dans le SNC de souris immuno-compétentes et les résultats seront suivis par BLI, l'IRM et l'histologie (figure 1).

Protocole

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Préparation des cellules

  1. Les expériences doivent être initiée à l'aide de culture ex vivo des populations de cellules souches génétiquement modifiées pour exprimer des protéines rapporteur de la luciférase et eGFP. Ici, nous utilisons la luciférase / eGFP exprimant murins de moelle osseuse des cellules dérivées du stroma (BMSC-Luc/eGFP) tels que décrits précédemment par Bergwerf et al. 2, 5.
  2. Deux jours avant le marquage cellulaire, les cellules BMSC-Luc/eGFP plaque à une densité de 8 x 10 5 cellules par flacon de culture T75 dans 15 ml d'expansion à moyen complet (CEM) supplémenté avec 1 ug / ml. Puromycine
  3. Laisser les cellules à croître pendant 48 heures à 37 ° C et 5% de CO 2.
  4. Ajouter 5 x 10 6 glaciaires bleus de taille micronique des particules d'oxyde de fer (GB MPIO) moyen par ml de culture à la culture cellulaire de plus en plus (total: 75 x 10 6 particules par 15 ml du milieu de culture dans un flacon T75 culture).
  5. Incuber pendant 16 heures pour permettre l'absorption de particules par endocytose.
  6. Laver les particules restanteset permettent aux cellules de se développer pour une période supplémentaire de 24 heures pour obtenir une répartition cellulaire confluence et homogène de la MPIO Go.
  7. Valider l'absorption des particules visuellement en utilisant la microscopie par fluorescence en comptant le rapport de la EGFP + et GB MPIO + de cellules à la quantité totale de la EGFP + cellules.
  8. Laver les cellules Go BMSC-Luc/eGFP MPIO-étiquetés à deux reprises avec 10 ml de PBS et les cellules de récolte à la suite de trypsine-EDTA de traitement (5 ml par flacon T75 culture pendant 5 minutes).
  9. Laver les cellules récoltées et remettre en suspension à une concentration finale de 133 x 10 6 cellules / ml dans du PBS.
  10. Gardez les cellules sur de la glace jusqu'à la transplantation.

2. L'implantation de cellules dans le SNC de souris

  1. Anesthésiez souris par une injection intrapéritonéale d'une kétamine (80 mg / kg) + xylazine (16 mg / kg) mélange.
  2. Attendre 5 minutes pour permettre à des souris à s'endormir.
  3. Rasage de la tête de la souris pour permettre les manipulations stériles.
  4. Placez la souris dans un cadre stéréotaxique.
  5. Désinfecter l'la peau et les yeux mouillés de la souris pour éviter la déshydratation.
  6. Faire une incision du cuir chevelu ligne médiane pour exposer le crâne, et percer un trou dans le crâne à l'aide d'une perceuse fraise dentaire aux coordonnées données: 2 mm en arrière et 2 mm latéralement à Bregma.
  7. Vortex de la suspension cellulaire brièvement et aspirer la suspension cellulaire dans la seringue.
  8. Placez l'aiguille de seringue à une profondeur de 2,5 mm sous la dure-mère et permettre d'équilibrage de pression pendant 1 minute.
  9. Injecter une suspension à 3 cellules ul (4 x 10 5 cellules) à une profondeur de 2 mm sous la dure-mère et à une vitesse de 0,70 l / min en utilisant un système automatisé de micro-injection de la pompe.
  10. Attendez 5 minutes supplémentaires pour empêcher le reflux de la suspension cellulaire injectée.
  11. Lentement retirer l'aiguille et à désinfecter les frontières de la peau avant de suturer la peau.
  12. Injecter 300 ul solution NaCl 0,9% sous-cutanée afin d'éviter la déshydratation, et placez la souris sous une lampe chauffante pour récupérer de l'anesthésie. Administrer post-opératoire analgésique en conformité avec les normes institutionnelles.

3. Dans bioluminescence in vivo

  1. Anesthésier les souris par un mélange de 3% d'isoflurane et l'oxygène.
  2. Placez la souris dans le Photon Imager et réduire le niveau de l'anesthésie à l'isoflurane 1,5% et de l'oxygène.
  3. Injecter 150 mg D-luciférine par kg de poids corporel par voie intraveineuse.
  4. Acquérir l'image pendant 5 minutes en utilisant le logiciel Vision photo.
  5. Effectuer le traitement d'image en utilisant le logiciel M3vision. Quantifier le signal observé à l'aide des régions d'intérêt fixes.

4. Dans l'imagerie par résonance magnétique in vivo

  1. Anesthésier les souris avec 3% d'isoflurane dans un mélange de O 2: N 2 O (3:7).
  2. Placez la souris dans le dispositif de retenue d'un système horizontal 9.4T MR et réduire le niveau de l'anesthésie à l'isoflurane 1% dans un mélange de O 2: N 2 O (3:7).
  3. Mouiller les yeux des souris afin de prévenir la déshydratationtion, attacher une sonde rectale pour surveiller la température du corps et surveiller le taux de respiration en plaçant un capteur en dessous du ventre de la souris.
  4. Maintenir le taux de respiration à 110 ± 10 respirations par minute et maintenir la température corporelle constante dans une fourchette étroite de 37 ± 0,5 ° C.
  5. Placer la bobine RF surface au-dessus de la tête de la souris et la position de la souris dans le milieu de l'aimant.
  6. Acquérir un ensemble de 10 coronales pondérées en T2 écho de spin (SE) des images pour obtenir des informations spécifiques à l'anatomie et pondérées T2 * écho de gradient (GE) des images afin d'étudier la migration de cellules souches avec une résolution dans le plan de 70 um 2. Définissez les paramètres de séquence comme suit: temps de répétition (TR): 500 ms, temps d'écho (TE): 8 ms (séquence GE) et temps de répétition (TR): 4200 ms, temps d'écho (TE): 12,16 ms (SE séquence); champ de vision (FOV): 18x18 mm 2, la matrice: 256x256, une épaisseur de 1 mm et 1 tranche de séparation tranche mm (5,1 Paravision logiciel).
  7. Effectuer le traitement des donnéesutilisant Amira 4,0 logiciel.

5. Post Mortem Histologie

  1. Anesthésier les souris très profondément par l'inhalation de l'oxygène isofluorane (4%), (0,5 L / min) et de l'azote (1 L / min) le mélange pendant 2 minutes. Sacrifiez les souris par dislocation cervicale.
  2. Retirez le cerveau de souris à partir du crâne et fixer le tissu cérébral dans du paraformaldéhyde 4% dans du PBS pendant 2 heures.
  3. Déshydrater les tissus du cerveau en plaçant le cerveau par la suite dans différents gradients de saccharose: 2 h dans 5% de saccharose dans du PBS, 2 heures dans du saccharose à 10% dans du PBS, pendant la nuit dans du saccharose à 20% dans du PBS.
  4. Congeler le tissu cérébral utilisant de l'azote liquide et stocker le tissu à -80 ° C jusqu'à ce que la coupe.
  5. Section du tissu cérébral dans 10 um d'épaisseur à l'aide des sections d'un cryostat.
  6. Écran souillé cryosections pour la fluorescence bleue des particules MPIO Go et de la fluorescence verte à partir des cellules exprimant eGFP l'aide d'un microscope à fluorescence.
  7. Écran souillé cryosections pourfluorescence de fond vert / rouge à partir de cellules inflammatoires.
  8. Effectuer des colorations immunohistochimiques et plus immunofluorescence pour identifier les populations cellulaires endogènes (par exemple les microglies, les astrocytes, des cellules T, ...) qui interagissent avec des greffes cellulaires.

6. Les résultats représentatifs

Nous avons ici présenté visuellement une séquence optimisée des événements pour l'imagerie multimodale réussie de la luciférase / eGFP-populations de cellules exprimant (tige) dans le SNC de la souris. Dans un premier temps, les résultats décrits Go MPIO procédure de labellisation en matière d'étiquetage très efficace des cellules BMSC-Luc/eGFP, qui peuvent facilement être validées en utilisant la microscopie à fluorescence (figure 2A). Ensuite, au moment de greffage de Go MPIO étiquetés BMSC-Luc/eGFP dans le SNC de la souris, la survie de la greffe cellulaire peut être contrôlée par in vivo BLI basée sur l'activité luciférase (figure 2B). En outre, la localisation exacte des cellules greffées peuvent être surveillés par in vivo (figure 2C). Enfin, l'analyse histologique permet de valider les résultats obtenus par BLI et de l'IRM. La survie stable a été confirmé par une expression de l'EGFP stable dans le temps (figure 2D). Pour cela, colocalisation des cellules exprimant eGFP avec bleu fluorescent MPIO permet la détermination exacte de la localisation et la survie des cellules greffées. En outre, ce double étiquetage fluorescent des cellules souches réduit la possibilité d'observer des résultats faussement positifs basés sur la fluorescence de fond créé par les cellules inflammatoires 5.

figure-protocol-1
Figure 1. Vue d'ensemble de la séquence de traitement

  1. Marquage des cellules: BMSC-Luc/eGFP sont marqués avec 5 x 10 6 particules MPIO GB par ml du milieu de culture. Après 16 heures d'incubation et une période de repos qui suit de 24 h, les cellules sont récoltées pourl'implantation intracérébrale.
  2. L'implantation de cellules: GB MPIO étiquetés BMSC-Luc/eGFP sont greffés dans le cerveau de la souris aux coordonnées suivantes: bregma -2 mm, 2 mm à droite de la ligne médiane et 2 mm sous-mère.
  3. In vivo BLI: Après l'administration intraveineuse de 150 mg D-luciferin/kg poids corporel, la lumière générée a été acquis pendant 5 minutes en utilisant le Photon Imager.
  4. En IRM in vivo: Un ensemble de 10 coronales pondérées en T2 écho de spin (SE) et des images pondérées T2 * écho de gradient (GE) des images avec une résolution dans le plan de 70 um ont été acquis 2. Paramètres de la séquence étaient les suivants: temps de répétition (TR): 500 ms, temps d'écho (TE): 8 ms (séquence GE) et temps de répétition (TR): 4200 ms, temps d'écho (TE): 12,16 ms (séquence SE); champ de vision (FOV): 18x18 mm 2, la matrice: 256x256, une épaisseur de 1 mm et 1 tranche de la séparation coupe mm.
  5. Post-mortem histologie: 10 microns d'épaisseur Coupe à congélation ont été criblées pour eGFP exprimer et bleu marqué par fluorescence BMSC uchanter un microscope à fluorescence.

figure-protocol-2
Figure 2. Imagerie multimodale des greffes de cellules souches

  1. Immunofluorescence directe des glaciaire bleu (GB) MPIO étiquetés BMSC-Luc/eGFP.
  2. In vivo BLI des souris injectées avec 4x10 5 Go MPIO a marqué les cellules BMSC-Luc/eGFP à la semaine 1 et semaine 2 après l'implantation. L'analyse statistique des signaux détectés BLI à la semaine 1 et semaine 2 post-implantation. Les données sont exprimées en nombre moyen de photons par seconde et par stéradian par centimètre carré (ph / s / sr / cm 2) à partir d'une période de temps de 5 minutes + / - erreur-type calculée à partir d'une région d'intérêt fixe chez la souris montrant un signal clair BLI au niveau du site d'injection.
  3. Coronale à deux dimensions IRM de GB MPIO étiquetés BMSC-Luc/eGFP (panneau de gauche: (i) en pondération T2 écho de spin et (ii) T2 *-image pondérée en écho de gradient) et non marqué BMSC-Luc / eGFP (panneau de droite: (iii) en pondération T2 écho de spin et (vi) T2 *-image pondérée en écho de gradient) des greffes dans le cerveau de la souris.
  4. L'analyse histologique de GB MPIO étiquetés implants BMSC-Luc/eGFP à la semaine 2 post-implantation. (I) l'analyse immunofluorescence directe pour la localisation de eGFP exprimant et GB greffes MPIO BMSC-Luc/eGFP étiquetés. (Ii) les informations à fort grossissement de (i). (Iii) La coloration par immunofluorescence pour antigène GFAP, indiquant le développement de tissu cicatriciel astrocytaire dans les environs de Go MPIO étiquetés BMSC-Luc/eGFP. (Vi) La coloration par immunofluorescence pour Iba-1 antigène, ce qui indique l'invasion et l'entourant de GB MPIO marqué par la microglie BMSC-Luc/eGFP.

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Discussion

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Dans ce rapport, nous décrivons un protocole optimisé pour la combinaison de trois modalités d'imagerie complémentaires (BLI, l'IRM et l'histologie) pour la caractérisation détaillée des implants cellulaires dans le SNC de la souris immunitaires compétentes. Une combinaison de l'étiquetage gène rapporteur de cellules, basée sur la modification génétique avec des gènes rapporteurs luciférase de luciole et eGFP, et un étiquetage directe de la cellule avec Go MPIO, conduit à une évaluation précise des greff...

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Déclarations de divulgation

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Les auteurs déclarent aucun conflit d'intérêts.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le travail des auteurs a été soutenue par une subvention de recherche ID-BOF 2006 du l'Université d'Anvers (accordé à la PPO et AVDL), par des subventions de recherche et G.0136.11 G.0130.11 (accordée à AVDL, ZB et PPO) et 1.5.021.09. N.00 (accordée à PPO) du Fonds de la Recherche Scientifique-Flandre (FWO-Vlaanderen, Belgique), par l'OSK de subvention de recherche IWT-60838: BRAINSTIM de l'Institut flamand pour la science et la technologie (accordée à ZB et AVDL), en partie par une subvention de recherche de Mathusalem, le gouvernement flamand (accordée à ZB), en partie par CE-FP6-NoE DiMI (LSHB-CT-2005-512146), CE-FP6-NoE EMIL (LSHC-CT-2004-503569) , et par le Polonais Inter Universitaire de sortie IUAP-NIMI-P6/38 (accordée à AVDL). Nathalie De Vocht titulaire d'un doctorat-bourse d'études de la FWO-Vlaanderen. Peter Ponsaerts est un chercheur post-doctoral de l'FWO-Vlaanderen.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Nom du réactif Entreprise Numéro de catalogue Commentaires
IMDM Lonza BE12-722f Composante de la CEM moyen de croissance des cellules
Sérum de veau fœtal Gibco 10270-106 Composante de la CEM moyen de croissance des cellules
Sérum de cheval Gibco 1605-122 Composante de la CEM moyen de croissance des cellules
La pénicilline-streptomycine Gibco 15140 Composante de la CEM moyen de croissance des cellules
Fungizone Gibco 15290-018 Composante de la CEM moyen de croissance des cellules
PBS Gibco 14190
Puromycine Invivogen ant-pr-1
trypsine Gibco 25300
GB MPIO Bangs Laboratories ME04F/7833
D-luciférine Promega E1601
La kétamine (Kétalar) Pfizer
Xylazine (Rompun) Bayer Health Care
L'isoflurane Isoflo 05260-05
0,9% de NaCl Baxter
paraformaldéhyde Merck 1.04005.1000
saccharose Applichem A1125
Micro-pompe à injection KD scientifique KDS100
Photon imageur Biospace Lab
9.4T MR scanner Bruker Biospin Biospec 94/20 USR
BX51 microscope Olympe BX51
Mycrom HM cryostat Prosan HM525
seringue Hamilton 7635-01
Aiguille de calibre 30 Hamilton 7762-03
Photo Vision logiciels Biospace Lab
M3vision logiciels Biospace Lab
Paravision 5.1 Logiciels Bruker Biospin
Amira 4.0 du logiciel Imagerie Visage

Références

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Mots-clés

Transplantation de cellules souchesImagerie par bioluminescenceImagerie par r sonance magn tiqueAnalyse histologiqueCellules stromales de la moelle osseuseParticules d oxyde de fer fluorescentes de taille microm triqueExpression de l EGFP et de la lucif raseImplantation dans le cerveau de sourisProc dure d injection st r otaxiqueValidation histologique postmortem

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