Mesure des variations de la concentration de calcium intracellulaire et de l&#39;efficacité synaptique dans le mollusque<em&gt; Aplysie</em

Résumé

Nous montrons comment les changements dans la concentration de calcium libre intracellulaire et l'efficacité synaptique peut être surveillés simultanément dans une préparation de ganglion Aplysie. Nous l'image de calcium intracellulaire à l'aide d'un colorant fluorescent, orange calcium, et d'induire et de contrôler la transmission synaptique avec tranchants (intracellulaire) électrodes.

Résumé

Il a été suggéré que les changements dans le calcium intracellulaire médiation de l'induction d'un certain nombre d'importantes formes de plasticité synaptique (par exemple, la facilitation homosynaptique) ^1. Ces hypothèses peuvent être testées en même temps surveiller les changements dans le calcium intracellulaire et des changements dans l'efficacité synaptique. Nous démontrons comment cela peut être réalisé en combinant l'imagerie calcique avec les techniques d'enregistrement intracellulaire. Nos expériences sont menées dans un ganglion vestibulaire du mollusque Aplysia californica. Cette préparation a un certain nombre de caractéristiques avantageuses expérimentalement: Ganglia peut être facilement retiré de l'aplysie et expériences utilisent neurones adultes qui font de connexions synaptiques normales et ont une distribution normale d'ions canal. En raison de la faible taux métabolique de l'animal et les températures relativement basses (14-16 ° C) qui sont naturels pour l'aplysie, les préparations sont stables pendant de longues périodes de temps. Calcium ent "> Pour détecter les changements dans le calcium intracellulaire libre, nous allons utiliser la version portable imperméant de calcium Orange ² qui est facilement« chargé »dans un neurone par ionophorèse. Lorsque cette teinture fluorescente grande longueur d'onde se lie au calcium, augmentation de l'intensité de fluorescence. Orange a propriétés cinétiques rapides ³ et, contrairement aux colorants ratiométriques (par exemple, le Fura 2), ne nécessite pas de roue de filtres pour l'imagerie. Il est assez photo stable et moins phototoxique que d'autres colorants (par exemple, fluo-3) ^2,4. Comme tous les non-ratiométrique colorants, de calcium Orange indique les changements relatifs à la concentration de calcium. Mais, car il n'est pas possible de tenir compte des changements dans la concentration de colorant dues au chargement et à la diffusion, elle ne peut pas être calibré pour fournir les concentrations de calcium absolus.

Une verticale, microscope fixe composé stade, a été utilisé pour les neurones d'image avec une caméra CCD permet d'enregistrer environ 30 images par seconde. Chez l'aplysie cette résolution temporelleest plus que suffisant pour détecter même un seul pic induit par la modification de la concentration de calcium intracellulaire. Électrodes pointues sont utilisées simultanément pour induire et d'enregistrer la transmission synaptique dans les neurones identifiés pré-et post-synaptiques. À la fin de chaque essai, un script personnalisé combine électrophysiologie et des données d'imagerie. D'assurer une bonne synchronisation on utilise une impulsion de lumière provenant d'une diode montée dans l'orifice de caméra du microscope. La manipulation des niveaux calciques présynaptiques (par exemple via l'EGTA injection intracellulaire) nous permet de tester des hypothèses spécifiques, concernant le rôle du calcium intracellulaire dans la médiation de diverses formes de plasticité.

Protocole

1. Préparation

1. Anesthésier l'animal en injectant 75-100 ml solution isotonique de chlorure de magnésium. L'aplysie nous utilisons pour l'imagerie sont généralement 150-200 grammes et sont obtenus à partir Marinus scientifique.
2. Pin l'animal anesthésié dans un plat recouvert de cire. Aiguilles de seringues fonctionnent bien à cette fin, les techniques stériles ne sont pas nécessaires. En utilisant des pinces et ciseaux bruts standards faire une incision dans le pied de l'animal et d'exposer la masse buccale. Localisez le ganglion vestibulaire. Avec des ciseaux à ressort et pinces fines, soigneusement gratuitement le....

Discussion

Nous démontrons techniques qui peuvent être utilisées pour surveiller simultanément la concentration de calcium intracellulaire et d'évaluer l'efficacité de la transmission synaptique. Ces techniques sont utiles pour déterminer comment les différentes formes de plasticité à court terme sont médiatisés.

La formation d'image est effectuée avec un microscope à fluorescence et une caméra CCD. Ces besoins en équipement sont relativement modestes par rapport à la plupart des fonctions .......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Nom réactif	Entreprise	Numéro de catalogue	Commenter
Calcium orange	Invitrogen	C-3013
EGTA	Sigma	E-4378
Kit tampon de calcium étalonnage	Invitrogen	C-3008MP	utile pour tester la sensibilité et la gamme dynamique du signal d'
Chlorure de magnésium hexahydraté	Sigma	M0250	utilisé en 0.33 M de solution pour anesthésier des animaux

Nom de l'équipement	Entreprise	Commenter
FN-1 microscope droit à fluorescence	Nikon Instruments	avec Narishige ITS-FN1 étape
NMN-21 manipulateurs	Narishige	monté sur scène avec des aimants
CooISNAP HQ 2 caméra CCD	Photométrie
Éléments NIS AR (Version 3.22)	Nikon Instruments	logiciel d'imagerie utilisé pour acquérir les données de fluorescence
10X/0.3w Plan Fluor objectif	Nikon Instruments	cette lentille à immersion de l'eau a une très longue distance de travail de 3,5 mm
X-Cite 120 lampe aux halogénures métalliques PC	EXFO	utilisé pour l'imagerie de fluorescence
LS-DWL Lampe halogène	Sumica
ET-CY3 ensemble filtre	Technologie Chroma	;
1401 puissance convertisseur A / N	Cambridge Electronic Design	échantillonnage a été effectué à 3 kHz
Pic II (Version 7.07)	Cambridge Electronic Design	logiciel utilisé pour acquérir des données d'électrophysiologie
SEC-10 LX amplificateur	NPI électronique	utilisé avec un headstage 10X
Modèle 410 amplificateur	Brownlee précision	utilisé pour amplifier et filtrer le signal d'
WS-4	moins k Technology	isolation des vibrations pour l'imagerie
plate-forme de refroidissement	sur mesure	plaque en laiton à travers lequel de l'eau glacée est pompée à un débit variable