L'isolement et la culture primaire de cellules de foie de rat

Résumé

Hépatocytes primaires constituent un outil précieux pour évaluer biochimiques, moléculaires fonctions, et métabolique dans un système physiologiquement pertinente expérimentale. Nous décrivons un protocole fiable pour le rat en perfusion du foie in situ, ce qui génère constamment hépatocytes viables jusqu'à à 1,0 × 10 ⁸ Cellules par la préparation avec la viabilité des cellules entre 88 ~ 96%.

Résumé

La culture des hépatocytes primaires est un outil précieux qui a été largement utilisé dans la recherche fondamentale de la fonction hépatique, la maladie, la physiopathologie, la pharmacologie et autres sujets connexes. La méthode basée sur la perfusion de collagénase en deux étapes pour l'isolement des hépatocytes intacts a été introduite par Berry et ami en 1969 ¹ et, depuis lors, a subi de nombreuses modifications. La technique la plus couramment utilisée a été décrite par Seglenin 1976 ^2. Essentiellement, les hépatocytes sont dissociées de rats adultes anesthésiés par une perfusion de collagénase non-recirculation par la veine porte. Les cellules isolées sont ensuite filtrée à travers un 100 um de taille des pores du filtre en nylon de maille, et mis en culture sur des plaques. Après 4 heures de culture, le milieu est remplacé par du milieu contenant du sérum ou sans sérum, par exemple HepatoZYME-GDF, un délai supplémentaire pour la culture. Ces procédures nécessitent des étapes de la culture chirurgicales et stérile qui peut être mieux démontrée par la vidéo que par le texte. Havant, nous documentons les étapes détaillées pour ces procédures à la fois par la vidéo et protocole écrit, ce qui permet de manière cohérente dans la génération des hépatocytes viables dans de grands nombres.

Protocole

1. Préparation

Tous les tampons sont fraîchement préparés en utilisant une technique stérile et stérilisé par filtration à l'aide d'un filtre Corning um 0,22.

1. Préparer perfusion je tampon en ajoutant ce qui suit à la solution saline équilibrée de Hank (HBSS, sans Ca ^{2 +} et Mg ^{2 +,} voir le tableau 1): Mg ^{2 +} (MgCl ₂₎ à 0,9 mM, EDTA à 0,5 mM, et HEPES à 25 mM.
2. Préparer un tampon de perfusion II en y ajoutant ce qui suit à HBSS (avec Ca ^{2 +} et Mg ^{2 +,} voir le tableau 1): HEPES à 25 mM....

Discussion

Culture primaire d'hépatocytes est un modèle in vitro largement utilisée pour étudier divers aspects de la physiologie et la pathologie du foie. Par exemple, la culture principale est utilisée pour évaluer l'expression et la fonction de enzymes métabolisant les médicaments, y compris cytochromes P450, métabolisme des médicaments, des interactions médicamenteuses, et les mécanismes de cytotoxicité et la génotoxicité ^3-7. Le protocole décrivant l'isolement et la culture de cellules.......