Malgré les efforts en cours pour les cultures de transition vers d'alimentation sans conditions, la dérivation et la culture de cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) restent largement tributaires des co-cultures avec mangeoires embryonnaires de souris (MEF). Ici, nous montrons une nouvelle méthodologie pour éliminer rapidement départs à partir de cultures de CSEh avant l'expérimentation.
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Article de méthode
Suppression des fibroblastes rapide de haute densité embryonnaires humaines cultures de cellules souches
Dans cet article
Résumé
Résumé
Souris fibroblastes embryonnaires (MEF) ont été utilisés pour établir des cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) après l'isolement des cultures blastocyste 1. Ce système d'alimentation maintient CSEh à partir de subir une différenciation spontanée lors de l'expansion cellulaire. Cependant, cette méthode de co-culture demande beaucoup de travail, nécessite un personnel hautement qualifié, et la pureté des rendements CSEh faible 4. De nombreux laboratoires ont tenté de minimiser le nombre de cellules nourricières dans les cultures de CSEh (c.-à matrice incorporant boîtes revêtues ou d'autres types de cellules nourricières 5-8). Ces systèmes de culture modifiés ont montré une certaine promesse, mais n'ont pas supplanté la méthode standard pour la culture des CSEh avec la mitomycine C traités par les fibroblastes de souris embyronic afin de retarder indésirables différenciation spontanée des cultures de CSEh. Par conséquent, les cellules nourricières utilisés dans l'expansion de CSEh doivent être retirés au cours d'expériences de différenciation. Bien que plusieurs techniques sont disponibles pour la purification de la coopération CSEhlonies (FACS, MACS, ou l'utilisation de vecteurs résistants aux médicaments) de mangeoires, ces techniques demandent beaucoup de travail, coûteux et / ou destructive à l'CSEh. L'objectif de ce projet était d'inventer une méthode de purification qui permet la récolte d'une population pure de CSEh. Nous avons observé que dans une culture confluente CSEh, la population MEF peut être enlevé en utilisant une aspiration simple et rapide de la feuille MEF. Cette suppression est tributaire de plusieurs facteurs, y compris latéral de cellule à cellule de liaison de MEF qui ont une faible affinité de liaison à la boîte de culture styrène, et la capacité des colonies de cellules souches à pousser les fibroblastes vers l'extérieur lors de la génération de leurs propres " niche ». Le CSEh ont ensuite été examinés pour SSEA-4, Oct3 / 4 et Tra 1-81 expression jusqu'à 10 jours après le retrait du MEF pour assurer le maintien de la pluripotence. En outre, les colonies de CSEh ont été en mesure de poursuivre sa croissance dans de grandes formations après le retrait du MEF, offrant un niveau supplémentaire de l'expansion sur les CSEh.
Protocole
1. Préparation des mangeoires embryonnaires de souris
- La FAE utilisé dans la co-culture des CSEh doivent être préalablement traités par irradiation ou mitomycine-C pour inhiber les cellules en cours de division de.
- Deux heures avant le semis, MEF, manteau chaque plasma de 60 mm boîte de culture traitée avec 2 ml de 0,05% de gélatine.
- Décongeler une fiole de traité MEF et la plaque à ~ 20.000 cellules / cm 2.
- Permettre aux cellules d'adhérer nuit.
2. Co-ensemencement CSEh sur les MEF
- De nouvelles colonies peut être initiée à partir de cultures cryoconservés ou repiqua....
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Discussion
La méthode présentée dans ce manuscrit offre une alternative rapide et moins coûteux à éliminer les cellules nourricières de fibroblastes humains à partir de cultures de cellules embryonnaires. La suppression réussie de fibroblastes est subordonnée à l'existence d'une monocouche serrée confluente de ces cellules qui se développe en plus des cultures de cellules souches. Après 7-10 jours, les colonies de CSEh croissance va pousser les fibroblastes nourriciers vers l'extérieur, générant une monocouche de fibro.......
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Déclarations de divulgation
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Remerciements
Ce travail a été financé par une nouvelle Faculty Award II du California Institute of Regenerative Medicine (RN2-00921-1), et un prix financée par les NIH National de la Recherche (F32-HL104924)
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Nom du réactif | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires (optionnel) |
| DDR2 | Santa Cruz | 7555 | Marqueur fibroblastes |
| Dapi | Calbiochem | 268298 | Marqueur noyau cellulaire |
| SSEA-4 | Millipore | MAB4304 | CSE humaines Marker |
| Oct 3/4 | Santa Cruz | 9081 | CSE humaines Marker |
| Flk-1 | BD Pharma | 555307 | Marqueur de différenciation précoce |
| Tra-1-81 | Acris | AM20377AF4-S | CSE humaines Marker |
Tableau 1. Tableau des raisons spécifiquesgents utilisés pour l'immunomarquage CSEh.
Références
- Bongso, A., Fong, C. Y., Ng, S. C., Ratnam, S. Isolation and culture of inner cell mass cells from human blastocysts. Hum. Reprod. 9, 2110-2117 (1994).
- Reubinoff, B. E., Pera, M. F., Fong, C. Y., Trounson, A., Bongso, A. Embryonic stem cell lines from human blas....
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