Le façonnage d'une bicouche Hydrogel de contrôler la différenciation ASC

Résumé

Ce protocole met l'accent sur l'utilisation de la capacité inhérente de cellules souches de prendre exemple sur leur matrice extracellulaire environnante et être amené à se différencier en de multiples phénotypes. Ce manuscrit méthodes étend notre description et la caractérisation d'un modèle utilisant un hydrogel bicouche, composé de PEG-fibrine et le collagène, à la fois co-différencier les cellules souches adipeuses ¹.

Résumé

Les polymères naturels au fil des ans ont acquis plus d'importance en raison de leur biocompatibilité hôte et sa capacité à interagir avec les cellules in vitro et in vivo. Un domaine de recherche prometteur dans la médecine régénérative est l'utilisation combinatoire de nouveaux biomatériaux et des cellules souches. Une stratégie fondamentale dans le domaine de l'ingénierie tissulaire est l'utilisation de échafaudage tridimensionnel (par exemple, décellularisée matrice extracellulaire, les hydrogels, les micro / nano particules) pour diriger la fonction des cellules. Cette technologie a évolué à partir de la découverte que les cellules ont besoin d'un substrat sur ​​lequel ils peuvent adhérer, prolifèrent, et d'exprimer leur phénotype différencié et la fonction cellulaires ^2-3. Plus récemment, il a également été déterminé que les cellules non seulement utiliser ces substrats pour l'adhésion, mais aussi d'interagir et de prendre des repères à partir du substrat de matrice (par exemple, la matrice extracellulaire, ECM) ^4. Par conséquent, les cellules et les échafaudages ont une connexion réciproque quesert à contrôler le développement des tissus, l'organisation, et la fonction ultime. Les cellules souches adipeuses (CSA) sont mésenchymateuse, les cellules souches hématopoïétiques non-présents dans le tissu adipeux qui peut présenter de lignées multiples différenciation et servir comme une source facilement accessible de cellules (c.-à-pré-vasculaire endothélium et péricytes). Notre hypothèse est que les cellules souches adipeuses peuvent être dirigés vers différents phénotypes simultanément par simple co-culture entre eux dans des matrices bicouches ^1. Notre laboratoire se concentre sur la cicatrisation cutanée. À cette fin, nous avons créé une matrice composite unique à partir des biomatériaux naturels, de la fibrine, de collagène, de chitosan et qui peuvent imiter les caractéristiques et les fonctions d'un cutanée spécifique cicatrisation ECM environnement.

Protocole

1. Isoler des cellules souches adipeuses (CSA) ^{1, 5}

Remarque: Toutes les procédures ont été réalisées à température ambiante, sauf indication contraire.

1. Isoler adipeux périrénal chez le rat et de l'épididyme et laver avec une solution stérile de Hank saline tamponnée (HBSS) contenant 1% de sérum de veau fœtal (FBS) de ⁵ précédemment décrit. Cette étude a été menée en conformité avec la Loi sur la protection des animaux, les règlements d'application de protection des animaux et en conformité avec les principes du Guide pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire.
2. Émin....

Discussion

ASC sont bien connus pour leur facilité d'isolement et de capacité à se différencier vers différents types cellulaires. Avec les techniques décrites dans ce manuscrit, nous sommes en mesure d'exploiter la plasticité des CSA en exposant ces cellules à biomatrices multiples simultanément. Comme les cellules migrent loin de leur base CSM et entrer dans leur environnement extracellulaire, les cellules prennent exemple sur l'échafaud, et peut soit maintenir "caractère souche" (collagène) ou être induite.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Nom du réactif / équipements	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Solution saline équilibrée de Hanks (HBSS)	Gibco	14175	Consommables
Sérum fœtal bovin	Hyclone	SH30071.03	Consommables
Collagénase de type II	Sigma-Aldrich	C6685	Consommables
70-um Nylon Mesh Filter	BD Biosciences	352350	Consommables
100-um Nylon Mesh Filter	BD Biosciences	352360	Consommables
Système MesenPRO moyen de croissance	Invitrogen	12746-012	Consommables
L-glutamine	Gibco	25030	Consommables
CaCl 2 .2 H 2 O	Sigma	C8106	Consommables
T75 flacon de culture tissulaire	BD Biosciences	137787	Consommables
Chitosan	Sigma-Aldrich	448869	Consommables
Acide acétique	Sigma-Aldrich	320099	Consommables
N-octanol	Acros Organics	150630025	Consommables
Sorbitan-mono-oléate de	Sigma-Aldrich	S6760	Consommables
Hydroxyde de potassium	Sigma-Aldrich	P1767	Consommables
Acétone	Fisher Scientific	L-4859	Consommables
L'éthanol	Sigma-Aldrich	270741	Consommables
Trinitro benzènesulfonique	Sigma-Aldrich	P2297	Consommables
Acide chlorhydrique	Sigma-Aldrich	320331	Consommables
Ether éthylique	Sigma-Aldrich	472-484	Consommables
8-um Insère tissus plaque de culture	BD Biosciences	353097	Consommables
Tubes à centrifuger de 1,5 ml	Pêcheur	05-408-129	Consommables
Réactif MTT	Invitrogen	M6494	Consommables
Diméthylsulfoxyde	Sigma-Aldrich	D8779	Consommables
Qtracker portable kit de marquage (QTracker 655)	Sondes moléculaires	Q2502PMP	Consommables
Collagène de type 1	Travigen	3447-020-01	Consommables
Hydroxyde de sodium	Sigma-Aldrich	S8045	Consommables
Plaques à 12 puits de culture de tissus	BD Biosciences	353043	Consommables
Fibrinogène	Sigma	F3879	Consommables
Thrombine	Sigma	T6884	Consommables
Dérivée benzotriazole de polyéthylène	Sunbio	DE-034GS	Consommables
Tampon Tris Tablet (pH 7,6)	Sigma	T5030	Consommables
Centrifuger	Eppendorf	5417R	Equipement
Orbital Shaker	Nouveau-Brunswick Scienctific	C24	Équipement
Incubateur humidifié avec du CO de l'air-5% 2	Thermo Scientific	Modèle 370	Équipement
Agitateur à hélice	IKA	Visc6000	Équipement
Agitateur magnétique	Corning	PC-210	Équipement
Dessiccateur à vide	-	-	Équipement
Analyseur granulométrique	Malvern	STP2000 Spraytec	Équipement
Bain d'eau	Fisher Scientific	Isotemp210	Équipement
Spectrophotomètre	Beckman	Beckman Coulter DU Spectrophotomètre 800UV/Visible	Équipement
Vortex	Diagger	3030a	Équipement
Lecteur de microplaques	Molecular Devices	SpectraMax M2	Équipement
Lumière / microscope à fluorescence	Olympe	IX71	Équipement
Microscope confocal	Olympe	FV-500 microscope confocal à balayage laser	Équipement
Microscope Electronique à Balayage	Carl Zeiss	Leo 435 VP	Équipement
Microscope électronique à transmission	JEOL	JEOL 1230	Équipement