Un système d&#39;<em&gt; Ex vivo</emLa culture&gt; de pancréas embryonnaire

Résumé

Ici, nous décrivons une méthode pour l'isolement, la culture et la manipulation du pancréas embryonnaire de la souris. Cela représente une excellente Ex vivo Système pour l'étude des divers aspects du développement du pancréas, y compris la morphogenèse, la différenciation et la croissance. Explants de bourgeons pancréatiques peuvent être cultivées pendant plusieurs jours et utilisé dans une variété d'applications différentes, y compris l'ensemble de montage immunofluorescence et imagerie en temps réel.

Résumé

Le pancréas contrôle les fonctions vitales de notre corps, y compris la production d'enzymes digestives et la régulation de la glycémie ^1. Bien que dans la dernière décennie de nombreuses études ont contribué à une base solide pour la compréhension de l'organogenèse du pancréas, des lacunes importantes subsistent dans notre connaissance de la formation du pancréas au début ^2. Une compréhension complète de ces événements précoces donnent un aperçu de l'évolution de cet organe, mais aussi sur les maladies incurables qui ciblent le pancréas, comme le diabète ou le cancer du pancréas. Enfin, cette information sera générer un modèle pour l'élaboration de cellules en remplacement des traitements dans le cadre du diabète.

Au cours de l'embryogenèse, le pancréas provient de différentes excroissances embryonnaires de l'endoderme intestin antérieur dorsal et ventral à jour embryonnaire (E) 9,5 ^3,4 chez l'embryon de souris. Les deux excroissances evaginate dans le mésenchyme environnant solide épithéliumbourgeons l, qui subissent la prolifération, la différenciation et de branchement pour générer un organe pleinement matures ^2,5,6. Des preuves récentes ont suggéré que la croissance et la différenciation des lignées de cellules pancréatiques, y compris les productrices d'insuline des cellules β, dépend de la bonne tissulaire architecture, remodelage épithélial et le positionnement cellulaire dans l'épithélium pancréatique de branchement ^7,8. Cependant, comment morphogenèse de ramification se produit et est coordonné avec la prolifération et la différenciation dans le pancréas est largement inconnue. Ceci est en partie dû au fait que les connaissances actuelles sur ces processus de développement reposait presque exclusivement sur l'analyse des échantillons fixés, alors que les événements morphogénétiques sont très dynamiques.

Ici, nous présentons une méthode pour disséquer et de la souris en culture du pancréas embryonnaire ex vivo sur des bourgeons plats à fond de verre, ce qui permet la visualisation directe du pancréas en développement (figure 1). Ce culteure système est idéalement conçu pour la microscopie confocale à balayage laser et, en particulier, imagerie des cellules vivantes. Explants pancréatiques peuvent être préparés non seulement à partir d'embryons de souris de type sauvage, mais aussi à partir de souches de souris génétiquement modifiées (transgéniques ou knock-out par exemple), ce qui permet en temps réel des études de phénotypes mutants. En outre, ce système culture ex vivo est précieux pour étudier les effets des composés chimiques sur le développement du pancréas, ce qui permet d'obtenir des données quantitatives sur la prolifération et la croissance, l'allongement, la ramification, tubulogenèse et la différenciation. En conclusion, le développement d'une méthode in vivo du pancréas culture ex explant combiné avec l'imagerie haute résolution fournit une base solide pour l'observation d'événements morphogénétiques et de différenciation tels qu'ils se présentent dans l'embryon de souris en développement.

Protocole

Le protocole décrit ici a été adapté à la technique décrite à l'origine de Percival et Slack ⁹ et optimisé pour la microscopie confocale.

1. Revêtement de plats Glass Bottom Culture

Les étapes suivantes doivent être effectuées dans des conditions stériles dans une hotte à flux laminaire.

1. Explants pancréatiques sont cultivées dans des boîtes de Pétri de 35 mm à 20 mm de diamètre en verre micropuits bas (par exemple MatTek Corporation). Utilisez un plat à fond de verre par la culture de l'explant et pendant toute la durée de la culture. A la veille de la dissection et l'....

Discussion

Une fois le sort du pancréas est spécifié, les cellules progénitrices pancréatiques subissent une prolifération extensive, la différenciation et la morphogenèse, à terme, constituer un organe mature et fonctionnelle ^2,4. À l'heure actuelle, comment les branches se déroule dans le pancréas et la façon dont elle est reliée à la prolifération et la différenciation des progéniteurs est largement inconnue. Des cultures d'explants pancréatiques représentent un système idéal pour élucider ces processus e.......

Matériaux

Nom du réactif	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Anticorps: Carboxypeptidase E-cadhérine F-actine Le glucagon Insuline β1-intégrine Pdx1 Pdx1 Phospho-Histone H3	AbD Serotec Invitrogen Molecular Probes Immunostar Millipore Millipore Abcam Hybridome banque Signalisation cellulaire	1810-0006 13-1900 A-12373 20076 4011-01 MAB1997 ab47267 F109-D12 9706
Basal Medium Eagle (BME)	Sigma	B1522-500ML	Conservés dans des conditions stériles
Eau de qualité culture cellulaire	AAP	S15-012	Conservés dans des conditions stériles
Boîtes de culture (à fond de verre), 35 mm	MatTek Corporation	P35G 0-20-C-
Sérum d'Ane	Chemicon	S30-100 ml
Sérum de veau foetal Or	AAP	A15-151	Conservés dans des conditions stériles
La fibronectine	Invitrogen	330100-8	Stock sol. 1 mg / ml dans de l'eau de qualité culture cellulaire
Gentamicine	Invitrogen	15750-037	Conservés dans des conditions stériles
Glutamine	Invitrogen	25030-024	Conservés dans des conditions stériles
4-ainsi multipuits	Nunc	176740
Microscopes: Microscope confocal inversé (LSM 700) Stéréomicroscope (Discovery V12)	Zeiss Zeiss		Objectifs: C-Apochromat 10X / 0,45 W M27 (travail. dist 1,8 mm;. Profondeur d'imagerie ~ 100 mm), C-Apochromat 40X / 1,2 W Corr M27 (travail. dist 0,28 mm;. ~ Imagerie profondeur 50 um) Transillumination d'en bas et à fibres optiques d'éclairage par le dessus
Paraformaldéhyde	Roth	0335.3	Solution mère 20%
Pipette Pasteur (verre), 150 mm	VWR	HECH567 / 1
Pénicilline / Streptomycine	AAP	P11-010	Conservé dans c stérileonditions
Des boîtes de Pétri de 60 mm	Greiner Bio-One	628102
Des boîtes de Pétri de 35 mm	Greiner Bio-One	627161
1X PBS, pH 7,4	AAP	H15-002	Conservés dans des conditions stériles
Printemps Ciseaux lame de 8 mm courbé	Outils Fine Science	15023-10
Triton-X100	Roth	3051.3
Horloger foreceps Dumont # 5	Roth	K342.1